卵巢癌靶向荧光-MR纳米探针的制备及靶向作用

王克英 徐 凯 强金伟 方雨函 李勇爱 韩翠平*

卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，其起病隐匿、发展迅速，传统的影像学检查方法（超声、CT、MRI）主要以解剖显像为主， 常难以发现早期阶段的肿瘤，故75%的患者确诊时已属中晚期，5 年生存率小于50%，而早期卵巢癌的生存率可高达92%［1］，故对卵巢癌的早期精确的诊断和治疗是提高卵巢癌治愈率及改善患者生存质量的关键。因此发展一种安全的具有高灵敏度及特异度的诊断方法对于卵巢癌的早期诊断及治疗尤为重要。本研究拟采用简单合成策略，制备出荧光性能优良、T1 弛豫效率高、生物相容性较好的卵巢癌靶向Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb 纳米探针，为卵巢癌早期精确诊断提供理论和实验基础。

方 法

1. 纳米探针的制备

1.1 Mn-CNSs制备、纯化

将二乙三胺五乙酸0.197 g（0.5 mmol）、四水氯化亚锰0.098 g（0.5 mmol）去离子水（40 mL）在空气中55℃下磁力搅拌1 h（500 r/min），得到无色透明的水溶液；取上述溶液1 mL，加入0.01 mL 的乙二胺，在200℃的烘箱内加热1.5 h，得到固态的Mn-CNSs。加入0.1 mL 去离子水溶解，再加入0.2 mL 丙酮，在离心机中离心（10 000 r/min，5 min），丢弃上清液，保留底部沉淀，同样方法重复3 次后，得到纯净的Mn-CNSs，在37℃真空干燥箱烘干后室温保存备用。用电感耦合等离子体质谱仪检测Mn-CNSs 中锰离子的浓度。

1.2 Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb的制备

在室温搅拌条件下将硼酸钠（200 μL，500 mmol/L，pH=9.5）逐滴加入到Mn-CNSs 溶液（300 μL，9.5 mg/mL）中，加入戊二醛（100 μL，质量体积分数5%）搅拌1 h，再加入单克隆抗HE4 抗体（10 μL，1 mg/mL）搅拌1 h。然后，在冰浴搅拌条件下逐滴加入硼氢化钠（100 μL，20 mg/mL），1 h后将溶液保存在4℃冰箱12 h，即得到卵巢癌靶向纳米探针Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb。用紫外吸收光谱及Zeta电位验证偶联。

2. 纳米探针的形貌表征

使用发射透射电子显微镜（TEM） 观察Mn-CNSs 的形态、大小、分布等。采用荧光分光光度法测定不同波长时的激发光谱、发射光谱，以0.001 mol的硫酸奎宁为参比物，计算Mn-CNSs的荧光量子产率。将纯化后的Mn-CNSs根据ICP-MS检测出锰离子的含量，分别配制成0.15、0.52、1.05、2.01、3.14 mmol/L 的Mn-CNSs 水溶液，用3.0 T GE 750 W MR 仪测量各浓度的T1 弛豫时间，计算Mn-CNSs 的T1 弛豫效率。扫描参数如下。①T1WI：TE=Min Full，TR=425 ms，FOV=18 cm×18 cm，矩阵=224×224，层厚=3.0 mm；②T1-Map 序列：TE=Min Full，TR=5 100 ms，FOV=18 cm×18 cm，矩阵=224×224，层厚=3.0 mm。

将纯化后的固态Mn-CNSs配制成1.5 mg/mL的水溶液，取100 μL滴在单晶硅板上，烘干，反复5遍后完成制样，进行X 射线衍射分析（XPS）分析。测试参数：单色Al Ka（hv=1 486.6 eV），功率150 W，500 μm 束斑。取适量纯化后的固态Mn-CNSs，分别与溴化钾按1∶20 质量比混匀、研磨、压片。用傅立叶变换红外光谱仪进行扫描，扫描波长约400～4 000 cm-1，叠加平均次数为16次。

3. Mn-CNSs的毒性

3.1 Mn-CNSs的细胞毒性

采用新型四唑化合物（MTS）法测定细胞生长存活率，取HO-8910 细胞及EA.hy926 细胞，均匀接种于96 孔培养板，分别加入质量浓度为0 mg/mL（对照组）、0.03 mg/mL、0.09 mg/mL、0.18 mg/mL、0.37 mg/mL、0.55 mg/mL、0.74 mg/mL 的 含Mn-CNSs 培养基溶液，每个浓度设置8 组平行实验。培养24 h 后加入MTS 继续培养4 h，采用酶标仪读取每孔的光密度（OD）值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=As的OD值/Ac的OD值×100%。

3.2 Mn-CNSs的活体毒性

将小鼠尾静脉注射150 μL（0.35 mg/mL）Mn-CNSs，对照组小鼠注射等体积的去离子水，设置3组平行实验，分别在7 天后解剖实验组和对照组小鼠，获得心、肝、脾、肺、肾器官并用甲醛进行固定，送病理科用苏木精-伊红染色法制作切片，在光学显微镜下观察组织结构。

4. Mn-CNSs的稳定性与生物相容性

4.1 常温下Mn-CNSs荧光及磁性的稳定性检测

将Mn-CNSs 水溶液制成3 个平行样本，常温下放置，分别在0、0.25、0.5、0.75、1.0、2.0个月时测量发射光谱的峰值强度及磁共振T1 弛豫时间变化情况。

4.2 Mn-CNSs的生物相容性

将用肝素钠稳定的新鲜血液离心（1 200 r/min，15 min），用PBS 洗涤以获得小鼠红细胞（MRBC）。用0.8 mL 水（作为阳性对照）、0.8 mL PBS（作为阴性对照）及0.8 mL（0.35 mg/mL）Mn-CNSs 分别稀释MRBCs。放置2 h 后离心（10 000 r/min，1 min），留存上清液，用UV-2450UVeVis 分光光度计测定吸光度值，按公式计算溶血率。溶血率（%）=（A试-A阴）/（A阳-A阴）×100%。

5. 卵巢癌细胞靶向荧光及磁共振成像

将HO-8910细胞及EA.hy926细胞培养孔中分别加入350µg/mL Mn-CNSs、350µg/mL Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb及磷酸盐缓冲液各600µL，分别记为Ab（-）组、Ab（+）组、PBS组，每组设3个平行样本。样品置于荧光倒置显微镜下观察，用不同波长的激发光进行激发，行相同视野下的荧光显像。用3.0 T Discovery 750 W MR仪扫描样品，测量各组样品的T1弛豫时间。

6. 统计学分析

采用SPSS16.0 软件包进行统计学分析。定量资料以均数±标准差(xˉ±s)表示。两组间计量资料的比较采用t检验，多组间计量资料的比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD 法检验。按检验水准α=0.05，P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

1. Mn-CNSs的形貌、表征、性能

制备的Mn-CNSs 加入去离子水后，在自然光源下呈淡黄色、透明均质溶液（图1A），在紫外灯365 nm 反射光源下呈明亮的蓝色荧光（图1B））。磁共振扫描T1WI呈明显的高信号（图1C）），ICP-MS测得Mn-CNSs 中锰的含量为22.99 mg/L。透射电镜图显示Mn-CNSs 呈斑片状，分布尚均匀，无明显的聚集现象（图1D），其内可见间距为0.22 nm 的平行晶格条纹。Mn-CNSs 的粒径（n=30）为（20.3±0.75）nm（图1E）。最佳激发波长位于380 nm 处（图2A），最大发射波长位于442 nm 处（图2B）。以0.001 mol的硫酸奎宁为参比物，计算得到Mn-CNSs 的荧光量子产率为52.53%［2］，T1 弛豫率r1 为（10.41±1.84）L·mmol-1·s-1（图3）。

Mn-CNSs 的XPS（图4A）结果显示：290.68、407.58、540.98 和659.58 eV 处的5 个主要峰对应于C1s、N1s、O1s和Mn2p，原子浓度分别为59.75%C、20.08%O、19.27%N 和0.91%Mn。C1s、N1s、O1s（图4B～D）高分辨谱显示Mn-CNSs 中存在位于284.6 eV 的C-C 键、285.2 eV 的C-N 键、287.3 eV 的C=O键、398.2 eV 的N-H 键及531.1 eV 的C=O 键。Mn 2p3/2 谱（图4E）显示在639.3 eV 有一明显的波峰及在641.2 eV 有一较小波，提示Mn-CNSs 中锰的价态是二价和三价，且二价锰居多。

Mn-CNSs 的FTIR 图谱（图4F）显示：在3 000～3 700 cm-1处出现一宽大的吸收峰，其代表O-H 和N-H 的吸收峰，同时还可以观察到在2 960 cm-1处和1 105 cm-1处C-H 的伸缩振动、1 587 cm-1处C=O 的伸缩振动、1 402 cm-1处C=C 的伸缩振动，1 325 cm-1处C-N 的伸缩振动。而Mn-O/Mn-N 在615 cm-1处的伸缩振动峰则代表Mn 离子与N-CNSs 的配位吸收峰。

Mn-CNSs、Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb 的紫外吸收光谱图（图5）显示，Anti-HE4 mAb 在278 nm 处存在特征性吸收峰，而Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb 比Mn-CNSs在301 nm 处新增了Anti-HE4 mAb的特征性吸收峰，说明Anti-HE4 mAb 已成功组装到与Mn-CNSs 分子探针表面，由于纳米粒子与抗体结合后相邻粒子间作用力的改变，Anti-HE4 mAb 的吸收峰出现蓝移现象。

2. Mn-CNSs的毒性

图6A 为加入不同质量浓度Mn-CNSs 后HO-8910细胞、EA.hy926 细胞的生存率。如图所示，Mn-CNSs 在0～0.37 mg/mL 质量浓度时对两种细胞均无明显毒性，组间比较差异无统计学意义（均P＜0.05），且每种细胞的平均生存率均在90%以上；而在0.55～0.74 mg/mL 时呈现细胞毒性作用，随着质量浓度的递增，两种细胞生存率均递减（P＜0.05）。

从小鼠的肾、脾、肝、心和肺的组织病理结果（图6B）可以看出，所有被检器官与对照组相比较，均无明显的器质性病变、炎症或其他异常。说明Mn-CNSs应用于活体时无明显毒性作用。

3. Mn-CNSs的稳定性、生物相容性

常温条件下，Mn-CNSs 不同时间点荧光强度曲线（图7A）及磁共振信号强度变化曲线（图7B）显示，对不同时间点Mn-CNSs 的荧光强度、T1 弛豫时间进行分析时未见明显变化。采用单因素重复测量方差分析，结果显示不同时间点间差异无统计学意义（F=1.547，P＞0.05；F=2.012，P＞0.05）。根据溶血实验公式可得（0.35 mg/mL） Mn-CNSs 的溶血率为2.41%（＜5%），说明Mn-CNSs 应用于细胞及活体时无明显溶血作用。

4. 卵巢癌细胞靶向荧光及磁共振成像

卵巢癌靶向荧光分子探针Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb 的靶向荧光成像结果（图8）示HO-8910 细胞的Ab（+）组在不同激发光下通过荧光显微镜观察到明显的荧光。在同样条件下，HO-8910细胞Ab（-）组及EA.hy926 细胞的Ab（+）组未出现明显的荧光信号。实验结果说明在本实验条件下，卵巢癌靶向分子探针Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb 实现了对HO-8910 卵巢癌干细胞的靶向荧光成像。

T1WI 图像（图9）显示，Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb 与HO-8910 细胞作用后，HO-8910 细胞的Ab（+）组的T1WI 信号明显增高，而HO-8910 细胞的Ab（-）组、PBS 组及EA.hy926 细胞的Ab（+）组、Ab（-）组、PBS 组的T1WI 信号均明显低于HO-8910 细胞的Ab（+）组。并且，HO-8910 细胞的Ab（+）组在不同激发波长激发下通过荧光显微镜观察到多色的荧光，具备激发依赖的特性。

讨 论

近年来，荧光-磁共振双模态纳米探针的研究发展迅速，它以MRI 高分辨率的优势获得解剖和病理生理信息，以荧光成像的高灵敏度、光稳定性获得分子和细胞层面的信息，将两种成像技术相结合，设计、开发出荧光-磁共振双模态纳米探针，实现优势互补和交叉验证，进一步提高肿瘤早期诊断的准确性与灵敏度，是肿瘤成像技术未来主要的发展方向［3-4］。

理想的靶向纳米探针需要同时具备荧光性能优良、弛豫效率高、稳定性好、低毒性和靶向性。钆基复合物（如Gd-DTPA，Gd-DOTA）是目前已经被广泛使用的磁共振造影剂，然而，从复合物释放的Gd3+在体内累积并且不能被完全代谢，Gd3+通过抑制钙离子通道可以引起相当大的生物毒性，并可导致肾功能不全患者的肾系统纤维化［5］。为了提高生物安全性，本研究用Mn2+来代替Gd3+，锰是生理代谢的必需元素，体内生物系统可以有效地控制锰在体内的平衡，锰基螯合物由于其良好的生物相容性，可作为潜在的钆基替代造影剂用于T1加权成像［6］。但Mn基纳米粒子的成像性能（典型r1＜0.5 L·mmol-1·s-1）远低于商业基于钆的对比剂（r1≈3.4 L·mmol-1·s-1）［7］，故提高Mn 基对比剂的弛豫效率是开发设计锰基对比剂的关键。

碳元素是生命体最重要的组成元素之一，以碳元素为主要组成成分的荧光碳点具备荧光性能优良、毒性低、生物相容性好、易于大规模合成及功能化修饰、制备成本低廉、反应条件温和以及稳定性好等无可比拟的优势［8］。其中碳纳米片是一种新型的二维碳纳米材料，具有独特的结构（二维单晶结构）、超大的比表面积（吸附性强）、血液循环时间长等优势，可作为多种生物分子、药物的有效载体，有希望取代量子点成为新型荧光纳米材料［9］。

我们研究组既往选择与Mn2+有较强络合能力的有机小分子为碳化原料，通过一步反应得到兼具荧光和MRI 的双模态Mn2+掺杂的碳点（Mn-CDs），进一步靶向修饰得到肿瘤靶向荧光/MRI 双模态分子影像探针［10］，该探针具有较低的生物毒性和较高的荧光发光效率，但T1 弛豫效率相对较低（3.26 L·mmol-1·s-1），导致活体成像的灵敏度不高，其主要原因是由于碳点的颗粒较小，负载的Mn2+的量较少。故本研究选择表面积较大的二维碳纳米材料为载体，提高Mn2+的负载量，则有可能改善这一问题，所得纳米材料弛豫效率高达（10.41±1.84）L·mmol-1·s-1，为临床上常用的钆基对比剂（r1≈3.4 L·mmol-1·s-1）的3倍。既往研究表明，掺杂氮元素可以显着地改变碳纳米粒子的光学性质、化学活性及荧光量子产率［11］，故本研究将乙二胺作为表面纯化剂，同时提供氮源，所得纳米材料量子产率高达52.53%，为传统碳点（约10%）的5倍［12］。

当纳米探针被应用于生物传感器和细胞成像的前提是具有低毒性和良好的生物相容性。溶血实验结果显示Mn-CNSs 的溶血率＜5%，表明Mn-CNSs 不会引起明显的溶血反应，可用于细胞及活体研究。碳纳米粒子具有毒性低、生物相容性好等优势，但掺杂后的纳米粒子可能会产生过量的活性氧自由基，引起细胞膜的破坏、DNA 的断裂、染色体的固定、线粒体功能的受损，最终造成细胞的死亡［13］。本研究从细胞和活体两个层面对其毒性进行了探究，Mn-CNSs 的质量浓度达到0.52 mg/mL，对细胞和活体均无明显毒性。在常温下，Mn-CNSs 纳米材料稳定性较高，这对材料的生产、包装、贮存、运输均提高了便利。

肿瘤细胞特有的分子靶点已成为肿瘤特异性诊治的有效依据，纳米探针靶向分子与肿瘤分子靶点的特异性识别作用，促使探针在肿瘤细胞处富集，进而实现 肿 瘤 靶 向 成 像［14］。 人 附 睾 蛋 白4 （human epididymis protein 4，HE4）在卵巢癌组织及患者血清中高表达，而在正常组织（包括卵巢）中表达较低，灵敏度为72%，特异度高达78%［15］，因此，HE4可作为卵巢癌的一个潜在的靶目标及具有诊断价值的标志物。本研究以Anti-HE4 mAb 为靶向亲和成分，以Mn-CNSs 探针为信号响应分子，通过戊二醛交联法，将戊二醛的两个醛基分别与分子和抗体蛋白的氨基形成希夫碱，再将它们以5 个碳原子连接起来，成功构建卵巢癌靶向纳米探针Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb，并实现了对HO-8910 卵巢癌细胞的荧光-磁共振双模态主动靶向成像。除此之外，在HO-8910细胞的靶向荧光成像中Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb 组在不同激发光下通过荧光显微镜观察到多色的荧光，与单一荧光相比，可以为细胞成像提供更精确的信息，这大大提高了检测的效率及准确度，为多色荧光纳米标记奠定了基础。

总之，本研究通过简单的策略成功制备了荧光性能好、T1 弛豫效率高的新型荧光-磁共振双模态纳米对比剂，通过戊二醛交联法构建了卵巢癌肿瘤靶向-荧光-磁性多功能纳米探针Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb，并实现了对HO-8910 卵巢癌细胞的多色荧光-磁共振成像和靶向性，为卵巢癌早期精确诊断提供理论和实验基础。然而本研究仍停留在体外细胞实验的基础上，尚未对活体内的主动靶向双模态成像进行研究，后续我们将对以上内容进行深入探究。