免疫检查点抑制剂治疗晚期非小细胞肺癌的预后标志物动态监测研究进展

代丽源，石远凯，韩晓红

国家癌症中心 国家肿瘤临床医学研究中心 中国医学科学院肿瘤医院 1检验科 2内科 3抗肿瘤分子靶向药物临床研究北京市重点实验室，北京 100021 中国医学科学院北京协和医院 4临床药理研究中心 国家药品监督管理局 药物临床研究与评价重点实验室 创新药物临床药代药效研究北京市重点实验室 5疑难重症及罕见病国家重点实验室，北京 100730

2020年GLOBOCAN发布数据显示，肺癌为全球新发病率(11.4%)第二、死亡率(18%)第一的癌症[1]，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占比最高(85%)。NSCLC包括腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌等病理组织亚型。由于缺乏有效的筛查手段及早期临床症状不典型，大部分NSCLC患者就诊时已为晚期，预后不佳[2]。随着针对表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)等靶向药物及抗程序性死亡[蛋白]- 1及其配体-1(programmed death- 1/ligand-1，PD- 1/L1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lym-phocyte associated antigen- 4，CTLA- 4)等免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICIs)的相继应用，晚期NSCLC的治疗方案从传统的手术、放疗、化疗逐渐过渡至靶向及免疫治疗[3]。

ICIs已成为无敏感基因突变的晚期NSCLC患者的标准治疗，被美国食品药品监督管理局批准用于治疗晚期NSCLC的抗PD- 1/L1免疫检查点抑制剂包括 PD- 1单抗如pembrolizumab、nivolumab，以及PD-L1单抗如atezolizumab等[4- 5]。ICIs治疗存在完全缓解、部分缓解、病情稳定、假性进展[6]、超进展(hyper-progressive disease，HPD)[7- 8]等一系列临床效应，并有可能发生免疫相关不良反应(immune related adverse events，irAEs)[9- 10]。其中晚期NSCLC患者的假性进展发生率可达2%～19%[11- 15]，HPD发生率较泛癌种高(13.8% 比 9%)，且HPD患者的生存获益更差[15- 16]。一项针对晚期NSCLC患者开展的nivolumab二线治疗多中心研究显示，irAEs发生率为51%，发生irAEs的患者相较于无irAEs的患者中位无进展生存期(progression-free survival，PFS)更长(9.2个月比4.8 个月)[17]。

ICIs治疗是一个肿瘤-免疫系统交互对话的动态过程，目前研究大多基于治疗前或治疗过程中某一时间点的标志物水平进行疗效预测，如组织标本肿瘤细胞表面PD-L1表达水平、肿瘤突变负荷(tumor mutational burden，TMB)、微卫星高度不稳定/错配修复缺陷(microsatellite instability-high/deficient mismatch repair，MSI-H/dMMR)及肿瘤免疫微环境中的CD4+、CD8+T细胞等。单点监测存在忽略肿瘤-免疫系统变化的时间异质性、非连续观测、不能结合前后变化准确实时反映治疗效果等问题，促使反映肿瘤-免疫系统交互对话特性的动态监测研究的兴起。动态监测可提供肿瘤时空异质性信息，有助于进行个体化监测，减少肿瘤间的异质性，从而更好地寻找合适的干预时间点，动态指导临床实践。由于连续获取检测标本存在难度大、时间长、成本高等问题，使得从分子水平对肿瘤细胞进行动态监测较为困难[18]。近年来，随着技术手段的进步以及ICIs的广泛应用，基于组织标本、液体活检方面动态监测ICIs预后生物标志物的研究逐渐增多，故本文对监测基线(行ICIs治疗前)及ICIs治疗后多个时间点的晚期NSCLC患者血液/组织标本中的预后标志物相关研究进行综述，以期为该领域相关研究的开展提供思路及方向。

1 ICIs治疗晚期NSCLC预后标志物动态监测的意义

ICIs治疗晚期NSCLC的患者反应率低(10%～30%)[19]，分析原因可能与肿瘤异质性及肿瘤微环境的动态变化有关。肿瘤异质性分为空间和时间异质性，可导致肿瘤进展及治疗过程中耐药的发生[20- 21]。在肿瘤进展过程中，肿瘤细胞-免疫微环境状态不断变化，如存在T细胞耗竭、T细胞表面标志物表达以及肿瘤免疫微环境组成成分变化等[22]。

在ICIs治疗过程中，即使是同一起点的患者，最终临床结局也可能大相径庭。Lesterhuis等[23]提出ICIs治疗肿瘤的过程是动态变化的，单纯静态分析将忽略条件变化对整个肿瘤细胞进化造成的影响。动态监测预后生物标志物，可找到接近临界点的信号，预测可能的治疗反应，实现疗效动态追踪、实时对照、及时捕获。预后生物标志物应具有捕获肿瘤-免疫系统交互动态对话的特性，可准确捕捉肿瘤克隆进化期间发生的变化，在多个时间点对肿瘤进行序列描述[24]。目前，关于ICIs治疗晚期NSCLC预后标志物动态监测的相关研究见表1。

表 1 ICIs治疗晚期NSCLC预后标志物动态监测相关研究

2 ICIs治疗晚期NSCLC的预后标志物

2.1 肿瘤细胞源性预后标志物

肿瘤液体活检具有微创性、样本易获得性、重复采样实用性等优势，可更好地帮助临床医生了解肿瘤随时间推移在分子水平上的变化[42]。现有肿瘤细胞源性预后标志物集中于监测循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)及循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)。

2.1.1 ctDNA

Iijima等[25]研究发现，基线及动态ctDNA的等位基因频率(allelic frequency，AF)下降与ICIs治疗的持久临床获益(durable clinical benefit，DCB)效应呈正相关，疗效好的患者AF大多在2周内迅速下降，疗效差的患者AF则持续升高。Goldberg等[26]将血浆ctDNA突变体等位基因分数(mutant allele fraction，MAF)下降>50%定义为ctDNA反应。ctDNA反应与PFS(HR=0.29，P=0.03)和总生存期(overall survival，OS)(HR=0.17，P=0.007)相关，且可预测影像学部分缓解(partial remission，PR)患者，ctDNA初始反应平均时间为24.5 d，而影像学出现PR的时间为72.5 d，ctDNA反应者具有更好的临床获益。

目前，已有研究通过动态监测ctDNA基因突变及基因突变负荷，实现对ICIs的疗效监测。Li等[27]研究表明，高基线血液肿瘤突变负荷(blood tumor mutational burden，bTMB)患者的PFS更长；克隆分析可早于CT扫描24个月检测到肿瘤进展。此外，通过对时序性血浆提取的ctDNA进行微滴式数字聚合酶链式反应分析显示，治疗后3或4周时的Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(Kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS)突变与肿瘤进展呈正相关。治疗后3或4周突变等位基因丰度的半定量指数(mutated allele fractional abundance，MAFA)增加与较高的进展性疾病发生率(aOR=7.3，P=0.0016)、较短的PFS(aHR=2.1，P=0.0142)和OS(aHR=3.2，P=0.0168)相关[28]。以上研究结果提示ICIs治疗过程中，ctDNA的AF或KRAS突变的MAFA水平下降与更好的临床获益相关，且可在影像学反应之前及时地预测治疗获益或肿瘤进展。

2.1.2 CTC

血液中的CTC水平在免疫治疗前后将发生变化，研究证实免疫治疗后CTC水平增加与免疫治疗效果不佳呈正相关[43- 44]，但尚缺乏连续多个时间点的动态研究证实。此外，研究表明部分PD-L1阴性(11%～20%)的患者仍可通过ICIs治疗获得临床获益[45- 47]。提示PD-L1免疫组化预测ICIs疗效的准确性有待提高，尚不能很好地区分获益人群。通过检测治疗前CTC表面PD-L1表达水平预测ICIs获益人群已有相关报道[48- 49]。Guibert等[50]研究发现CTC表面PD-L1表达阳性的患者更易成为治疗无效者(PFS<6个月)，疾病进展的患者均为CTC表面PD-L1表达阳性。同样，Nicolazzo等[29]动态监测患者CTC的PD-L1表达水平，结果显示在治疗前和治疗后3个月时，CTC表面PD-L1表达阳性与患者较差的预后呈正相关；在治疗后6个月发现CTC的患者中，CTC表面PD-L1表达阴性的患者均获得了临床获益，而PD-L1表达阳性的患者肿瘤均存在不同程度的进展。提示通过治疗和早期动态监测CTC的PD-L1表达水平，可尽早区分治疗获益人群，预测肿瘤进展。

2.2 免疫微环境源性预后标志物

ICIs治疗的关键在于免疫系统与肿瘤细胞相互作用、交叉对话，通过监测免疫微环境的生物标志物，如CD4+及CD8+T细胞亚群、中性粒细胞/淋巴细胞比值、细胞因子等可反映免疫系统与肿瘤细胞的博弈状态。

2.2.1 CD4+及CD8+T细胞亚群

研究发现，对ICIs治疗反应者治疗前血液中具有更高比例的CD62 Llow CD4+T (活化的CD4+T)细胞，对ICIs治疗无反应者具有更高比例的调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)(即：CD25+FOXP3+CD4+T细胞)；更高比例的CD62 Llow CD4+T 细胞与生存获益呈正相关。基于两种CD4+T细胞亚群建立模型预测反应者与无反应者，灵敏度达85.7%，特异度达100%[51]。除此之外，CD4+T细胞亚群在早期预测HPD发生方面亦有相关研究，低分化及中分化的T细胞表达CD28，而高分化的T细胞则不表达。Arasanz等[30]通过检测70例ICIs单药治疗患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，发现HPD患者在ICIs治疗第1、2周期出现CD28-CD4+T细胞的强烈扩增，相较于未发生HPD的患者，CD28-CD4+T细胞的治疗后/治疗前比值增高(1.525比0.990，P=0.0007)；根据CD28-CD4+T细胞治疗后/治疗前比值对患者进行风险分层，其灵敏度为70%，特异度为82%，提示HPD的发生可能与免疫微环境中淋巴细胞亚群的改变相关。

Kim等[31]研究发现，治疗前外周血中CD8+T细胞的PD- 1表达阳性与治疗反应无关，治疗1个周期后CD8+T细胞PD- 1表达降低>2%与患者发生DCB，以及较长的PFS(HR=0.323)、OS(HR=0.378)相关。此外，有研究发现，ICIs治疗后12周，CD8+T细胞表面的CX3CR1表达增加>20%与患者更好的客观缓解率(objective response rate，ORR)、PFS、OS相关，以此区分治疗有反应者与无反应者，灵敏度可达92.3%，特异度达87%[52]。上述研究结果提示，通过动态监测治疗前、治疗过程中外周血CD4+及CD8+T细胞亚群的变化可及时区分获益人群，监测肿瘤进展、HPD的发生。

2.2.2 T细胞克隆性

由于肿瘤细胞的异质性，可激活不同的T细胞产生不同的T细胞受体(T cell receptor,TCR)以识别肿瘤抗原；T细胞扩增也可形成具有相同TCR序列的多个细胞，即TCR克隆性扩增。通过TCR测序，有助于深入了解肿瘤免疫微环境的克隆多样性，认识肿瘤免疫应答过程[53- 54]。研究发现，肿瘤进展后肿瘤相关CD4+T细胞的TCR克隆丰度显著下降[32]。瘤内TCR克隆性更高，其术后肿瘤残留更低[33]。联合CD8+T细胞与TCR表位复杂度及克隆度，Han等[34]通过动态监测ICIs治疗前及治疗过程中(治疗后约4～6周)的T细胞发现，ICIs治疗前PD- 1+CD8+T细胞TCRβ-CDR3高复杂度患者相较于低复杂度患者具有更长的中位PFS(6.4个月比2.5个月，P=0.021)，ICIs治疗后TCR复杂度上升患者相较于下降患者具有更长的PFS(7.3个月比2.6个月，P=0.002)。由此可知，CD4+或CD8+T细胞TCR表位的高复杂度与患者更好的PFS呈正相关，动态监测治疗前后TCR表位的复杂度可预测ICIs疗效及肿瘤进展情况。

2.2.3 中性粒细胞/淋巴细胞比值及淋巴细胞/单核细胞比值

中性粒细胞/淋巴细胞比值(neutrophil to lympho-cyte ratio，NLR)反映了肿瘤炎症状态与抗肿瘤免疫反应的平衡。已有研究联合治疗前的NLR与乳酸脱氢酶建立肺癌免疫治疗预后指数(lung immune prognostic index，LIPI)，预测免疫治疗获益情况[35,55]。Nakaya等[35]对101例接受nivolumab单药治疗的患者进行研究发现，基线NLR水平与患者的PFS无关，而治疗后2周、4周NLR<3的患者相较于NLR≥3的患者中位PFS更长(5.3个月比2.1个月，P=0.0052；5.3个月比2.0个月，P=0.0051)。此外，Kiriu等[36]回顾性分析患者治疗前的NLR水平发现，治疗后NLR水平增加>30%的患者达到治疗失败的时间(time to treatment failure，TTF)明显短于NLR稳定或减少的患者。随后的研究相继证实，nivolumab治疗后6周，NLR相较于治疗前基线增加，与更短的PFS、OS呈正相关[56- 57]。为进一步验证NLR预测ICIs治疗疗效的能力，Valero等[58]在泛肿瘤(包括NSCLC、黑色素瘤、肾癌、结直肠癌、乳腺癌等)共16种癌症类型、1714例患者的大样本量回顾性研究中发现，更高水平的NLR与更差的生存率及治疗反应率相关；将NLR与TMB结合，相较于NLR高/TMB低组，NLR低/TMB高组具有更高的治疗反应率及生存获益(OR=3.22，95% CI：2.26～4.58，P<0.001)。Sekine等[37]动态监测162例接受nivolumab治疗患者的淋巴细胞/单核细胞比值(lymphocyte-to-monocyte ratio，LMR)，发现治疗后4周LMR水平升高≥10%(相对于基线)的患者相较于LMR水平稳定或升高<10%的患者，具有更高的ORR(39.4%比11.8%，P=0.0065)、更长的中位PFS(7.3个月比2.5个月，P=0.0049)及中位OS(15.6个月比 8.9个月，P= 0.014)。上述研究提示外周血NLR或LMR作为经济有效且易获得的生物标志物，具有一定的应用前景。

2.2.4 细胞因子

细胞因子水平与机体免疫状态及免疫治疗疗效密切相关。其中，白细胞介素(interleukin，IL)- 8可通过结合趋化因子受体CXCR1/CXCR2发挥调节炎症反应、刺激血管生成及促进肿瘤细胞增殖的作用。目前，已有多项治疗晚期NSCLC的在研药物靶向IL- 8/IL- 8R[59- 60]。研究显示，血清IL- 8水平在ICIs治疗前后的变化可预测和监测晚期NSCLC患者的治疗疗效，高水平的IL- 8与更差的预后呈正相关[60- 62]。此外，血清IL- 8水平早期下降不仅与NSCLC患者的OS延长相关，动态监测血清IL- 8水平还可反映假性进展的发生。动态监测3例NSCLC患者的影像学及血清IL- 8变化发现，假性进展患者影像评估显示肿瘤增大时，血清IL- 8水平较低并保持低于基线；在随后影像评估总体肿瘤质量降低时，血清IL- 8水平显著降低；而后直至肿瘤进展时，IL- 8较基线大幅增高[38]。此外，Keegan等[39]通过动态监测NSCLC患者IL- 6水平变化发现，IL- 6下降与更长的中位PFS(11 个月比4个月，P=0.04)及ORR呈正相关。提示血清IL- 8、IL- 6水平可预测免疫治疗疗效，IL- 8水平可作为诊断追踪假性进展的标志物，但上述研究纳入的病例数均较少，未来仍需扩大样本量进一步验证。

2.3 多指标联合预后标志物

单个标志物对于预后预测的有效性及准确性受限，多个指标联合可全面、充分地反映肿瘤-机体免疫系统间的动态变化。Anagnostou等[40]通过联合监测患者的ctDNA及TCR扩增，发现治疗未获益的患者相较于获益患者具有更短的中位PFS(5.2个月比14.5个月，P=0.007)和中位OS(8.4个月比18.7 个月，P=0.02)；治疗获益的患者在治疗开始后ctDNA水平降低、TCR扩增，而未获益患者的ctDNA水平无显著变化或增加、TCR无显著扩增；最初有临床反应而后产生耐药的患者，其ctDNA水平从治疗开始时下降转为上升。ctDNA可早于CT成像8.7周区分出临床获益人群。此外，Nabet等[41]结合组织样本、外周血、白细胞、CD8+T细胞及ctDNA等指标对99例接受单药或联合免疫治疗的患者进行动态监测，根据患者的临床获益将其分为DCB和非持久临床获益(non-durable clinical benefit，NDB)两组，建立了一种无创的多参数分析DIREct-On模型。DIREct-On模型在队列(n=34)中区分DCB及NDB患者的分类准确率为92%，曲线下面积为0.93，评分高的患者中位PFS明显长于评分低的患者(8.1个月比2.1个月，P<0.0001)。

3 小结与展望

随着ICIs在晚期NSCLC治疗中的广泛应用，寻找预测、监测ICIs治疗疗效有效且实用的生物标志物日益受到重视，单纯检测治疗前或治疗过程中单个时间点的生物标志物水平，易遗漏肿瘤治疗过程中很多变化的关键信息，而个体化动态监测有助于消除个体间的差异，监测肿瘤时空异质性，尽早区分免疫治疗获益人群，早期辨别假性进展及预测HPD。由于ctDNA、CTC液体活检存在检测平台及方法流程未标准化、CTC难以大量富集、纳入样本例数少、高通量测序价格相对较高等问题，目前尚未推广应用。其他具有应用潜力的生物标志物包括CD4+及CD8+T细胞亚群、NLR、LMR及细胞因子等，在晚期NSCLC患者ICIs治疗疗效(PFS、OS、DCB、NDB)预测方面均显现出一定作用，随着更多研究证据的产生，有望促进此类生物标志物在临床的应用。

目前，上述生物标志物尚未在临床推广应用，分析可能原因为：(1)治疗方式未限定。目前的研究未统一治疗方式(单药/联合、一线/后线)，多个研究[26，40- 41]同时纳入了单药及联合治疗方式，应分别进行分析比较。现有研究多集中于临床试验及单药治疗，而联合治疗的临床获益优于单药治疗。目前晚期NSCLC患者的临床治疗多采用联合治疗，提示未来应增加对联合治疗预后生物标志物的研究。(2)临床因素未校正。已有研究证实，PD-L1表达水平>50%(一线免疫治疗)、吸烟、无EGFR突变的患者更易从ICIs治疗中获益[63- 64]，因此应对研究中的混杂因素进行校正。(3)样本量小、缺乏新队列验证。由于动态跟踪随访样本具有难度，现有研究样本总数多集中于20～50例，且多为单个队列研究，缺乏大样本队列验证，研究结论可靠性差。(4)生物标志物的阈值未确定。各研究的采样间隔不同，但多集中于治疗前及治疗后2周、4周、6周、8周，能够较好地反映肿瘤细胞的变化情况。但这些研究界定的生物标志物阈值(如ctDNA、CTC、NLR)存在较大差异，如NLR相对于基线水平增加>30%、比值≥3或5均有报道，提示应开展更大的前瞻性队列研究以确定统一的阈值。(5)预测ICIs治疗获益的特异性与准确性低。以NLR为例，NLR水平与许多良性疾病(如肝炎)相关，考虑到晚期NSCLC患者多合并其他疾病，提示在进行标志物动态监测时，应辨别生物标志物水平变化是否为并发症所致。此外，化疗等治疗方式也可影响NLR水平，提示NLR预测ICIs治疗疗效易受外界因素的影响，特异性及可重复性低。(6)缺乏多指标联合应用模型。相对于肿瘤细胞源性预后标志物，免疫微环境源性预后标志物更易监测，现有研究多集中于后者，但其存在易受多种因素影响、稳定性及可重复性差等问题。此外，鲜有文献报道关于蛋白质组、基因组及代谢组学的动态监测。单一肿瘤细胞源性或免疫源性预后标志物不能充分反映肿瘤-免疫系统的变化过程，未来应联合多指标、多组学(转录组、蛋白质组、代谢组等)构建预测模型探索ICIs的预后标志物。

综上，动态监测相对于单个时间点检测有着独特的优势，但由于上述原因的存在，尚无成功转化至临床应用的先例。除限定治疗方式、纳入更多动态样本、进行队列验证及前瞻性探索、发现特异性反映免疫治疗疗效及多指标多组学构建预测模型外，还应注重ICIs临床效应(假性进展、HPD、irAEs)的个体化预测与动态监测，以促进临床及时调整治疗策略，使患者临床获益最大化。

作者贡献：代丽源负责文献检索、论文撰写及修订；韩晓红、石远凯负责论文选题和审校。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突