内生砖红镰刀菌对番茄生长和抗病的影响

肖青，李永杰，汪健康 ，查兴平，黄建明 ，何张江，康冀川

1.贵州大学西南特色药用生物资源开发利用教育部工程研究中心，贵阳 550025；2.贵州大学生命科学学院，贵阳 550025

早在4.6 亿年前的植物化石中就发现真菌孢子的存在，表明植物从开始出现就伴随着内生菌［1］。在长期的互作过程中，二者相互依存形成了稳定的共生关系。内生菌对植物的影响是全方位的，内生菌可以形成菌丝体网络促进植物对土壤中氮、磷等微量元素的吸收［2-3］；通过占据特殊的生态位，与病原菌竞争营养和生存空间［4］，显著提高植物对病虫害的抗性。此外，内生菌还可激活植物体内的防御机制从而达到增强植物抗性的目的［5］。近年来，国家出台的化肥和农药零增长的国策，促使人们寻找更环保更有效的策略以应对需求的缺口，内生菌因其对植物具有促生及抗病虫害的作用而成为农业生产上减少化肥和农药使用的理想选择。

大多数镰刀菌属真菌为植物病原菌，其寄主广泛，能感染多种作物，并造成严重经济损失［6］。但近年来，有研究报道内生镰刀菌对部分植物不但不会致病，还具有促生抗病的作用；然而，决定镰刀菌是否致病或促生抗病的关键在于其所处的生态位，不同的生态位下镰刀菌可对宿主可表现出有害、中立和有益等不同的作用［7］。例如，病原尖孢镰刀菌导致的香蕉枯萎病造成了巴拿马卡迪文许香蕉品种的灭绝［8］。中立的镰刀菌，能够存在于植物周围而不引起植物病害，但一旦条件成熟则转化为病原菌引起宿主感病，枯萎病、根腐病［9］都属于该类型。而有益的镰刀菌大多来源于植物内生生态位，如内生轮枝镰刀菌可通过分泌赤霉素改善植物抗盐胁迫的能力［10］，从辣椒根部分离的内生尖孢镰刀菌EF119 对番茄晚疫病具有良好的防治效果［11］。上述研究表明，镰刀菌对植物的致病性是寄主特异性的，对一些种类的植物具有致病作用的镰刀菌，在另外一些植物种类中具有促生抗病作用［12］。

镰刀菌属真菌由于所处生态位的关系，发挥着不同作用，特别是内生生态的镰刀菌对农业生产具有潜在的利用价值。笔者所在课题组前期研究发现，黔产马比木内生真菌砖红镰刀菌（Fusarium lateritium）对马铃薯具有促生抗病的作用［13］。为拓展该菌株的应用范围，本研究以同为茄科作物的番茄作为研究对象，探究砖红镰刀菌在番茄生长及抗病过程中的作用，旨在为该砖红镰刀菌的后期开发及实际应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

菌株与植物：砖红镰刀菌野生菌株（F.lateritium）由贵州大学生化工程中心分离、保存。Micro Tom 番茄（抗病品种）由东北农业大学许向阳教授馈赠；尖孢镰刀菌番茄专化型菌株Fol4287 由扬州大学欧阳寿强教授馈赠；花绣球（普通易感番茄品种）、次氯酸钠溶液、番茄水培营养液及营养土均购自贵州锐宏生物有限公司。

质粒：含潮霉素 B（hyg）抗性、GFP 片段的质粒pK2hyg由西南大学生物技术中心张永军研究员馈赠，贵州大学西南特色药用生物资源开发利用教育部工程研究中心保存。表达GFP荧光标记的砖红镰刀菌由笔者所在实验室构建、保存。

1.2 番茄种植及砖红镰刀菌的培养

番茄种子消毒方法参考文献［16］，略有改动。将Micro Tom和花绣球种子50 ℃温水浴浸泡25 min后，用0.75%次氯酸钠消毒15 min。蒸馏水漂洗6～8 次，漂洗后将种子浸泡于蒸馏水中置于28 ℃催芽3～5 d。待其发芽后采用3种方法培养：（1）用无菌镊子将Micro Tom 番茄转移至MS培养基上无菌生长；（2）将花绣球番茄根部浸没在水培营养液（按水培营养液配方说明书配制）中进行水培培养；（3）Micro Tom番茄直接种植于土壤中，用于后续研究。

将砖红镰刀菌接种至PDA 培养基培养6～8 d后挑取菌块至1/4 SDB 液体培养基中于28 ℃、180 r/min摇床培养4～6 d。

1.3 砖红镰刀菌对番茄生长的影响检测

将砖红镰刀菌接种在铺有无菌玻璃纸的CZM培养基上培养10 d 后，刮取菌丝并用0.05% Tween 80 重悬，制备含菌丝体与孢子的混悬液。并调整其分生孢子浓度为1×105CFU/mL，通过浸根法处理Micro Tom 番茄（下文除特别说明是“花绣球番茄”外，“番茄”都指“Micro Tom 番茄”）。取生长 14 d 后的番茄植株进行研究，对照组和处理组各25株番茄。每次接种5 mL 菌丝体悬液于番茄根部，对照组接种5 mL 含 0.05% Tween 80 的蒸馏水，每 4 d 浸根处理1次，共浸根处理10次，处理50 d时统计番茄株高、根系生物量。

1.4 番茄叶绿素提取方法

叶绿素提取及叶绿素含量计算参考王凤婷等［17］方法，略有改动。浸根法处理番茄50 d 后，取番茄叶位一致的叶片，洗净，擦干叶片表面水分，剪成2 mm细条，混匀后称取细条0.4 g 放入研钵中，吸取5 mL 95% 乙醇研磨提取，充分研磨后将番茄叶片研磨液过滤，转移至50 mL 棕色容量瓶中，并用95% 乙醇洗涤研钵和研磨棒上残余液体，最后用95% 乙醇定容至50 mL。过滤后的研磨液摇匀后分别于波长665、649 nm 处测定吸光度，重复3 次，并据此计算叶绿素含量。

1.5 砖红镰刀菌对番茄枯萎病抗性的影响检测

尖孢镰刀菌番茄专化型菌株Fol4287 于PDA 培养基上27 ℃生长10 d 后，刮取培养基上孢子并用0.05% Tween 80 悬浮，调整其浓度为1×107CFU/mL。选取水培培养1个月的花绣球番茄，处理组及对照组各15 株；对照组采用0.05%Tween 80 浸泡处理番茄根系，处理组采用1×107CFU/mL 砖红镰刀菌孢子悬液浸泡，32 h 后，采用1×107CFU/mL尖孢镰刀菌孢子悬液浸泡对照组及处理组番茄（花绣球）根系，处理35 min 后将花绣球番茄移入土壤中生长，14 d后观察植物生长及发病情况。

1.6 砖红镰刀菌介导番茄植物激素关键基因表达水平的检测

将经1×107CFU/mL 砖红镰刀菌孢子悬液浸根处理20 、30 、40 d 的番茄根系用水冲洗干净后液氮速冻，并提取番茄RNA。将其反转录为cDNA后，选用在番茄根和叶中表达均较为稳定的甘油醛3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）作为番茄内参基因［14-15］。采用RT-qPCR 法检测番茄中生长素合成关键基因SlYUC5、水杨酸合成关键基因SlICS1、茉莉酸合成关键基因SlLOXD及与植物抗性有关的一个病程相关蛋白基因SlPR1a［18］的表达水平。每个PCR 反应各进行3 次重复。反应条件：95 ℃预变性 90 s；95 ℃变性 5 s，56 ℃ 退火 15 s，72 ℃ 延伸 30 s，40 次循环。采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。研究中用到的相关引物见表1。

表1 逆转录实时荧光定量PCR引物Table 1 Primers for real time fluorescence quantitative reverse PCR

1.7 砖红镰刀菌在番茄中定殖的观察

将用MS 培养基上无菌培养的番茄根部浸泡在表达GFP 荧光标记的砖红镰刀菌1×107CFU/mL孢子悬液中，22 ℃静置14 h 后取出番茄植株。用蒸馏水冲洗干净番茄根部，加入终质量浓度为200 μg/mL 的碘化丙啶（propidium iodide，PI）。置 于37 ℃培养箱黑暗条件染色25～30 min，染色完成后，将植物根系用1×PBS 缓冲液洗涤4～6 次，每次冲洗时间不少于2 min。将染色处理后的根样固定在含10%甘油的载玻片上，并于激光共聚焦倒置显微镜成像系统（LSM900，ZEISS）的载物台上进行观察并拍照。

1.8 砖红镰刀菌定殖率的测定

按表2进行引物筛选，最终选定砖红镰刀菌特有基因FlEf1α进行研究。首先按本文“1.2”方法摇床培养砖红镰刀菌6 d 后收集砖红镰刀菌孢子，悬浮于无菌水中并调整其浓度分别为 108、107、106、105和104CFU/mL，按He 等［19］方法进行绝对定量标准曲线的制作。选取土壤中生长30 d 的番茄，用0.05%Tween 80 将砖红镰刀菌孢子浓度调整为1×107CFU/mL 后将番茄根部浸泡在孢子悬液中，收集0、6、12、24、48 h的番茄根系用水冲洗干净后液氮速冻，并提取番茄DNA。使用倍沃公司真菌gDNA提取试剂盒提取砖红镰刀菌DNA，提取方法严格按照说明书上进行。通过实时荧光定量PCR 结合标准曲线测定砖红镰刀菌定殖率。

表2 砖红镰刀菌实时荧光定量PCR引物筛选Table 2 Screening of real-time fluorescent quantitative PCR primers for F.lateritium

2 结果与分析

2.1 砖红镰刀菌对番茄生长的影响

浸根法处理番茄50 d 后测定植株的相关指标，结果显示：相较于对照组，经砖红镰刀菌处理后，番茄株高显著增加，处理组平均株高较对照组增加了1.15 倍（P＜0.01）（图1A、B）；处理组叶绿素 a 及叶绿素b 的含量均较对照显著增加（1.16 倍和1.47 倍，P＜0.01）（图1C、D）；砖红镰刀菌处理促进番茄植株根部发育（图1 E），且其根系生物量显著大于未处理的对照组（1.38 倍，P＜0.01）（图1 F）；表明砖红镰刀菌促进了番茄植株的生长。

图1 砖红镰刀菌对番茄株高（A、B）、叶片（C、D）和根系（E、F）的影响Fig.1 Effects of F.lateritium on tomato plant height（A，B），leaf（C，D）and roots（E，F）

2.2 砖红镰刀菌对番茄枯萎病抗性的影响

生测结果显示，处理组病情指数为45.16%，而对照组为74.15%（图2A、B），处理组较对照组病情指数下降。表明砖红镰刀菌增强了番茄植株对番茄枯萎病（病原菌为尖孢镰刀菌）的抗性。

图2 砖红镰刀菌对番茄枯萎病的影响Fig.2 Effects of F.lateritium on resistance to tomato fusarium wilt

2.3 砖红镰刀菌对番茄中植物激素关键基因表达的影响

为探究砖红镰刀菌是否能通过影响植物中激素表达而促进番茄生长及增强其对其他病原菌的抗性，通过RT-qPCR 检测了对照组及砖红镰刀菌浸根处理后（20、30、40 d）的番茄植株中植物激素相关基因的表达。结果显示，生长素合成关键基因SlYUC5在浸根处理20 d 后与未处理对照组相比无显著差异，而在处理 30 及 40 d 后，SlYUC5较对照组相比表达显著上升（3.4 倍和1.6 倍，P＜0.01）（图3A）；水杨酸合成关键基因SlICS1在浸根处理20 d后与未处理对照组相比无显著差异，但处理30 及40 d 后，其表达水平较对照组相比显著降低（45.36%和36.13%，P＜0.05，P＜0.01），而对照组SlICS1整体呈上升趋势，表明砖红镰刀菌下调了SlICS1的表达（图3B）；茉莉酸合成途径关键基因SlLOXD在20 d 时较对照组显著下调了38.73%（P＜0.01），而在30 d 时其表达量较对照组无显著差异，40 d 后，其表达量较对照组显著上调（2.33 倍，P＜0.01）（图3C）。而试验组中植物抗性相关蛋白 SlPR1a 在 20、30 和 40 d 的表达量被显著上调了7.89 倍、5.77 倍和1.8 倍（P＜0.01），表明植物防御可能存在高激活状态（图3D）。综上，我们推测内生砖红镰刀菌通过影响番茄中与植物生长和抗病相关的植物激素基因的表达，从而促进番茄生长并增强其抗性。

图3 砖红镰刀菌激活番茄中植物激素相关基因表达Fig.3 The expression of plant hormone-related genes is mediated by F.lateritium

2.4 砖红镰刀菌在番茄中定殖的观察结果

为检测砖红镰刀菌在番茄根系中的定殖状况，使用激光共聚焦倒置显微镜观察砖红镰刀菌定殖情况。结果发现，处理14 h 后在番茄根系能够观察到GFP 标记的砖红镰刀菌菌丝，并且在根细胞内观察到砖红镰刀菌菌丝生长（图4）。表明砖红镰刀菌能够内生定殖于番茄根系。

图4 表达GFP的砖红镰刀菌在番茄根系的显微观察Fig.4 Microscopic image of tomato roots stained with PI

2.5 砖红镰刀菌在番茄中的定殖率

为量化砖红镰刀菌在番茄根部的定殖程度，通过qPCR 检测其定殖率。以FlEF1α-F/R 为引物，绘制砖红镰刀菌绝对定量标准曲线，结果表明砖红镰刀菌孢子数与Cq值相关（图5A），以此标准曲线为参考，结合qPCR 结果表明砖红镰刀菌能够在番茄植株中定殖，且在6～48 h 其定殖率随着定殖时间的延长而显著增加（图5B）。

图5 荧光定量PCR法检测砖红镰刀菌在番茄中的定殖率Fig.5 Colonization rate of F.lateritium in tomato detected by fluorescence quantitative PCR

3 讨 论

前人在研究植物病原菌与植物互作时发现植物的生长往往与其抗病性负相关［20］，其原因在于促进植株生长的生长素与增强植株系统抗性的激素水杨酸存在拮抗关系。然而，有研究表明内生菌定殖能在促进植物生长的同时提高植物抗病性［21］，由此可以推测，病原菌和内生菌对植物的作用机制有着本质的区别。与病原菌一样，内生真菌功能的发挥同样依赖于成功定殖植物，这会触发植物的免疫防御系统，引发植物防御相关基因如病程相关蛋白基因PR1a的高表达［22］。本研究结果表明，番茄在接种内生砖红镰刀菌后其生长素合成相关基因SlYUC5表达水平显著提高，与植物生长素促进植物生长的功效一致。然而，有意思的是水杨酸合成途径关键基因SlICS1的表达显著下调，茉莉酸合成关键基因Sl-LOXD和病程相关蛋白基因SlPR1a的表达水平显著上调。由此推测，内生砖红镰刀菌可能通过迂回的方式，在抑制植物SA 通路促进定殖的同时，激活茉莉酸和病程相关蛋白基因的表达，增强植物抗病性［23］，实现促生与抗病相统一。内生菌抑制水杨酸合成、激活生长素和茉莉酸合成途径的机制还需要深入的探究；内生砖红镰刀菌的寄主谱也还要进一步的发掘，为将其开发成为“植物疫苗”奠定基础。