枸杞糖肽拮抗环磷酰胺诱导雏鸡免疫抑制的作用

王建东，唐玉林，王 敏，张宝所，杨富强，高海慧，于 洋，郭延生

(1.宁夏农林科学院动物科学研究所，银川 750002； 2.宁夏大学农学院动物科学系，银川 750021；3.宁夏银川市妇幼保健院，银川 750001；4.宁夏顺宝现代农业股份有限公司，宁夏 青铜峡 751600)

【研究意义】免疫抑制是指动物机体存在免疫功能障碍，导致免疫力下降，进而更容易受到病原的侵害[1]。目前饲料中禁止添加抗生素已成为养殖业的常态，因此有必要找到一种副作用小且有助于提高畜禽免疫力及生产性能的免疫增强剂，而大量研究表明从植物中提取的多糖具有增强免疫、促生长的作用。【前人研究进展】枸杞子是茄科植物枸杞的成熟果实，在中医上具有非常重要的地位，李时珍就在《本草纲目》中记载其具有滋肾、润肺、名目的功效。近年来，枸杞作为药食兼用的名贵资源受到国内外学者的关注，现代药理学研究表明枸杞子不仅营养十分丰富而且还具有多种保健功能。枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide，LBP)是枸杞生物活性功能的主要有效成分，具有无耐药性、无残留、安全、制造工艺简单等特点[2]。研究表明LBP具有抗氧化[3-4]、抗炎[5]、神经保护[6]、降血糖血脂[7]、免疫调节[8-9]等功能。LBP可以诱导NK细胞活化，增强NK细胞的细胞毒性，并能够通过Notch信号诱导树突状细胞的表型和功能成熟，并促进树突状细胞介导的细胞毒T淋巴细胞活性[10]。张海燕等[11]研究发现，在海兰褐蛋鸡日粮中添加50 mg/kg LBP可显著提高胸腺和法氏囊的重量，增加血清中白蛋白和溶菌酶含量，促进血液中CD3+T淋巴细胞增殖，由此可见，枸杞多糖具有提高机体免疫功能的临床功效。而枸杞糖肽(Lyciumbarbarumglycopeptide，LbGp)是从LBP中进一步分离纯化后得到的具有更强免疫活性的糖缀合物。【本研究切入点】病原微生物、营养、饲养管理、应激和药物等因素极易诱发鸡群免疫抑制，因此本试验拟研究通过肌注环磷酰胺(CY)诱导雏鸡产生免疫抑制，再通过饮水口服高、中、低剂量的LbGp，以生长状况、脾脏指数、外周血液淋巴细胞增殖率为评价指标，再辅以脾脏组织学切片分析，旨在探讨LbGp对CY诱导产生免疫抑制鸡的免疫调节作用。【拟解决的关键问题】本研究结果将为进一步研究枸杞糖肽拮抗免疫抑制雏鸡的作用机制提供基础数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物及药品 1 d龄海兰蛋鸡购自北京市华都峪口禽业有限公司。枸杞糖肽购自于宁夏天仁枸杞生物科技股份有限公司，试验地点在宁夏顺宝现代农业有限公司。

1.1.2 主要试剂及仪器 环磷酰胺(货号：A0505A，大连美仑生物技术有限公司)；鸡外周血淋巴细胞分离液试剂盒(货号：LTS1090C，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)；一次性试验动物静脉血样采集容器枸橼酸钠抗凝剂(货号：TBDTM-0001，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)；中性福尔马林固定液(10%NBF)(货号：G2161，索莱宝公司)；鸡外周血淋巴细胞完全培养基(货号：CM-C007，武汉普诺赛生命科技有限公司)；0.9%氯化钠注射液(批号：2012171911，陕西圣奥动物药业有限公司)；电子秤(型号LT502，上海第二天平仪器厂)自；CO2培养箱购自上海力申科学有限公司；组织切片机(型号：LEICA-RM2235，德国Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 试验分组与处理 将200羽1 d龄海兰蛋鸡，适应性饲养至7 d龄后随机分成5个组，每组40羽，即空白组(NC)、环磷酰胺组(CY)及LbGp高(LbGpH)、中(LbGpM)、低(LbGpL)3个剂量组，除NC组注射生理盐水外，其余4组连续3 d肌注80 mg/(kg·d) CY进行造模，造模后LbGp各组连续7 d分别给予10、5、2.5 mg/(kg·d) LbGp。在首次给药后的第7、14、21和28 天，每组随机选取5只鸡称重，随后取下脾脏称重，记录数据计算脾脏指数，其公式为：脾脏指数=脾重(g)/体重(g)×100。

1.2.2 淋巴细胞增殖测定 在首次给药后第7、14、21和28天，每组随机选取5只鸡无菌心脏采血，随后离心分离淋巴细胞，培养后采用MTT法测定淋巴细胞OD490nm值。

1.2.3 脾脏组织切片 在首次给药后第7、14、21和28天，每组随机选取5只鸡处死后取脾脏，将其完全放入10%NBF中，室温保存3 d，按常规操作制备石蜡切片后HE染色并镜检。

1.2.4 数据统计 使用SPSS 25.0进行One-way ANOVA检验分析各组间的差异显著性，结果用平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 枸杞糖肽对CY免疫抑制鸡体重的影响

由表1可知，在第7、14、21和28天，CY组免疫抑制雏鸡的体重均低于其余各组。其中第7天时，NC组体重显著高于LbGpH、LbGpL和CY组(P<0.05)；第14 天时，LbGpM组体重显著高于CY组和NC组(P<0.05)；第21天时，LbGpM组显著高于LbGpH，LbGpH显著高于CY组(P<0.05)，LbGpM极显著高于LbGpL、CY和NC组(P<0.01)；第27天时，LbGpM组体重显著高于LbGpH和LbGpL组(P<0.05)，LbGpM极显著高于CY和NC组(P<0.01)。

表1 枸杞糖肽对鸡体重的影响

2.2 枸杞糖肽对CY免疫抑制鸡脾脏指数的影响

由表2可知，在第7、14、21和28 天，CY组免疫抑制雏鸡的脾脏指数均低于其余各组。第7 天时，NC组显著高于CY组(P<0.05)；第14、21和28天时，LbGpM组均显著高于CY组(P<0.05)。

表2 枸杞糖肽对鸡脾脏指数的影响

2.3 枸杞糖肽对免疫抑制鸡外周血淋巴细胞转化的影响

由表3可知，在第7、14、21和28 天，CY组免疫抑制雏鸡的外周血淋巴细胞OD490 nm值均低于其余各组。其中第7 天时，LbGpM组外周血淋巴细胞OD490 nm值显著高于CY组(P<0.05)；第14天时，LbGpH、LbGpM和LbGpL组外周血淋巴细胞OD490 nm值均极显著高于CY组(P<0.01),NC组显著高于CY组(P<0.05)；第21天时，LbGpH、LbGpM组外周血淋巴细胞OD490 nm值极显著高于NC与CY组(P<0.01)；第28天时，LbGpH、LbGpM组外周血淋巴细胞OD490 nm值极显著高于LbGpL、NC和CY组(P<0.01)。

表3 枸杞糖肽对鸡外周血淋巴细胞转化的影响(OD490nm)

2.4 枸杞糖肽对免疫抑制鸡脾脏组织切片的影响

如图1所示，首次给药后的第7天各组淋巴细胞分布均匀，分组之间无明显差异(P>0.05)。如图2所示，第14 天时NC组生发中心个数约为25～30个；CY组生发中心个数约为20个，且生发中心缩小，边缘区模糊，脾窦增宽；LbGp各组生发中心个数约40～50个，显著高于NC和CY组(P<0.05)。如图3所示，第21 天时NC、LbGp各组生发中心个数约为30～40个；CY组生发中心个数约25～30个，显著低于NC和LbGp各组(P<0.05)，且生发中心缩小、脾窦增宽。如图4所示，第28 天时各组生发中心个数约为30～40个，分组之间无明显差异(P>0.05)。

图1 7 d枸杞糖肽对鸡脾脏组织结构的影响(HE染色，×10)

图2 14 d枸杞糖肽对鸡脾脏组织结构的影响(HE染色，×10)

图3 21 d枸杞糖肽对鸡脾脏组织结构的影响(HE染色，×10)

图4 28 d枸杞糖肽对鸡脾脏组织结构的影响(HE染色，×10)

3 讨 论

3.1 CY对雏鸡免疫功能的影响

CY是一种烷化剂类药物，常用于治疗自身免疫病和癌症，具有细胞毒性作用[12-13]，它可以破坏DNA结构，干扰其进行正常复制，并导致细胞死亡[14]。有研究表明，CY能降低T细胞的增殖能力以及减少Th1细胞和Th2细胞分泌细胞因子[15]，长期使用可导致机体出现免疫抑制等严重副作用[16]，因此CY常被用来构建免疫抑制模型。杨树宝等[17]在使用CY进行雏鸡免疫抑制造模，CY组雏鸡在体重、脾脏指数及外周血淋巴细胞转化作用等指标上明显低于正常组。周亚琳等[18]在使用CY诱导小鼠产生免疫抑制，其脾脏组织学病理切片镜检可见红髓和白髓界限不清、脾窦增宽，且出现脾脏淋巴细胞减少的现象。本试验结果显示CY组出现生长性能抑制、脾脏指数降低和外周血淋巴细胞转化减弱现象，并且脾脏组织学切片可见生发中心缩小、边缘区模糊、脾窦增宽，说明本试验雏鸡免疫抑制构建成功。

3.2 枸杞糖肽对CY免疫抑制鸡体重和脾脏指数的影响

体重可直接反映畜禽的生长情况，而脾脏则是畜禽最重要的免疫器官，免疫器官的发育情况能够直接影响机体的免疫功能[19]，尤其从脾脏衍生的一些巨噬细胞亚群能够发挥调节免疫系统的作用[20]。因此，通过体重和免疫器官指数可以在一定程度上反映机体的生长性能和免疫功能。而已有研究证明，CY可以明显减少脾脏淋巴细胞数量进而导致小鼠生长减缓和免疫器官重量明显降低[21-22]。同时，研究表明LbGp可以改善肉鸡的生长性能[23]，可以提高CY诱导产生免疫抑制小鼠的免疫器官指数和减轻免疫器官损伤[24]，LbGp还能够增加肠通透性和改变肠道组织学结构，抑制嗜中性粒细胞积累，降低TNF-α水平，提高脾脏淋巴细胞增殖率[25]。本研究也发现LbGp具有能提高CY诱导免疫抑制产蛋雏鸡的生长性能和脾脏指数的作用，其中LbGp中剂量浓度[5 mg/(kg·d)]效果最好。

3.3 枸杞糖肽对免疫抑制鸡外周血淋巴细胞的影响

淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分，在防御机体疾病方面发挥着巨大的作用[26]。淋巴细胞的作用是产生针对细菌、病毒、真菌、寄生虫和有毒化学物质的抗体，杀死入侵生物和感染细胞，并释放细胞因子以警告其他细胞存在危险[27]。外周血淋巴细胞，是指存在于外周血液循环中的淋巴细胞，能够引起机体免疫抑制剂量的CY可以导致外周血淋巴细胞数量迅速减少和免疫器官细胞异常凋亡[28]。有研究表明，淋巴细胞转化率的高低也可在一定程度上反映出机体免疫水平[29]。刘永利等[30]在日粮中添加4 g/kg LbGp可显著提高肉鸡外周血淋巴细胞转化作用。徐占云等[31]研究发现，在体外培养外周血淋巴细胞液中分别加入4、16、64、256 μg/mL LbGp均能够促进雏鸡淋巴细胞增殖，其中16 μg/mL浓度效果最好。另有研究表明，LbGp可以激活转录因子NFAT和AP-1，诱导IL-2和IFN-γ基因的转录和蛋白质的产生，并刺激T细胞产生Th1细胞因子，其诱导T淋巴细胞增殖速度为原来的3～4倍[32]。本试验结果也证明LbGp可以提高产蛋雏鸡外周血淋巴细胞转化作用。

3.4 枸杞糖肽对免疫抑制鸡脾脏组织学的影响

生发中心(GC)是在次级淋巴器官中发育的专门的微体系结构，是B细胞增殖、分化和产生高亲和力抗体的区域，在体液免疫过程中发挥着重要作用[33]。郝文丽[34]研究发现LbGp可修复亚健康小鼠被破坏的脾脏组织结构形态，显著增加淋巴细胞数量，说明LbGp可以起到恢复脾脏损伤的作用。本试验通过对鸡脾脏的组织学变化的观察，发现CY能够损伤鸡脾脏，减少生发中心数量和淋巴细胞数量，而LbGp能够在一定程度上促进脾脏损伤恢复。

4 结 论

本试验采用CY诱导雏鸡产生免疫抑制状态，研究LbGp对免疫抑制的拮抗作用，结果表明LbGp可以显著提高CY诱导产生免疫抑制雏鸡的生长性能，显著促进脾脏的发育，加快脾脏因CY带来损伤的恢复过程，极显著提高了CY诱导产生免疫抑制雏鸡外周血淋巴细胞的增殖能力，以LbGp中剂量组[5 mg/(kg·d) ]效果最好。