外源激素对灰霉菌胁迫下月季花器官生理生化指标的影响

高鹏华，王其刚，晏慧君，蹇洪英，周宁宁，鄢 波，唐开学，邱显钦,2

(1. 园林园艺学院，西南林业大学/国家林业局西南风景园林工程技术研究中心/云南省功能性花卉资源及产业化技术工程研究中心，昆明 650024；2. 云南省农业科学院花卉研究所，昆明 650205；3. 国家观赏园艺工程技术研究中心，昆明 650205)

【研究意义】月季是世界第一大切花，具有重要的观赏价值和经济价值[1-2]。灰霉病是月季采后运输过程中第一大真菌病害[3]。月季灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引起的，通常在月季发育早期附着在月季花器官表面，在采后运输过程中爆发，每年约15%～40%的切花月季由于采后腐败给切花月季市场造成巨大的经济损失[4-5]。目前，生产中主要通过喷施化学药剂进行防治，这不仅增加了生产成本还对环境造成了污染和破坏。因此，寻求更加有效的方法增强切花月季对灰霉菌的抗性对切花月季产业发展具有非常重要的意义。【前人研究进展】病原菌侵染过程中会导致植物体内发生一系列生理生化的变化，如活性氧、酶活性以及光合作用和呼吸作用等，以减轻植物受病原菌伤害的程度[6]。植物内源激素如水杨酸、乙烯、茉莉酸等能够通过诱导抗病相关基因的表达参与对病虫害的防御[7-8]。有研究表明，在番茄(Lycopersiconesculentum)中喷施水杨酸可显著提高水杨酸合成途径中PRs类基因的表达，增强其对灰霉病的抗性[9-10]。在苹果(Malusdomestica)中，水杨酸通过诱导其防御酶活性，提高抗病相关蛋白活性，降低膜脂的过氧化程度，增强苹果对灰霉病的抗性[11]。然而，在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中，水杨酸(Salicylic acid, SA)含量的增加对拟南芥灰霉病抗性没影响或只在原发感染部位产生抗性[12]。还有研究表明，月季[13-14]、葡萄(Vitisvinifera)[15]在油菜素内酯(Brassinolide, BR)处理后增强了对灰霉菌的抗性。外源茉莉酸(Jasmonic acid, JA)、1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, ACC)和乙烯(Ethylene, ET)气体处理增强了月季花瓣对灰霉菌的抗性[16]。【本研究切入点】近年来，对月季灰霉病的研究主要集中在病原菌分离鉴定、抗性评价、灰霉病相关抗病基因的研究[16-20]。对于不同激素处理后，切花月季灰霉病抗性影响及生理生化的变化还未见报道。【拟解决的关键问题】因此本研究以月季模式品种‘月月粉’(Rosachinensis‘Pallida’)为材料，对其在不同激素处理后的生理生化指标变化情况进行测定，探索不同激素对月季灰霉病的抗性诱导机制，以期为月季采后灰霉病的防治提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用云南省农业科学院月季种植基地保存的古老月季品种‘月月粉’(Rosachinensis‘Pallida’)为供试材料。

1.2 试验方法

试验于2020年7—10月在云南省国家工程花卉中心实验室内进行。

灰霉菌采用本课题组前期鉴别出的月季灰霉病菌生理小种A型、B型和C型混合种。

‘月月粉’正常生长3个月后开始进行处理。参考Cao等[16]的方法，分别将处于开花第二期的‘月月粉’瓶插入水(对照，CK)及JA(50 μmol)，SA(100 μmol)，ACC(100 μmol)，ABA(100 μmol)和BR(5 μmol)溶液24 h，每处理重复12支花。

处理后的月季花瓣用打孔器打成9 mm的花瓣圆盘，将花瓣圆盘置于水琼脂培养基(0.4%)中，每个花瓣圆盘中央滴加2 μL灰霉菌悬浮液(105conidia/mL)，分别培养0、36、60、72 h后对其生理指标进行测定，每个处理重复3次。

1.3 测定指标及方法

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性，过氧化物酶(Peroxidase, POD)活性，几丁质酶(Chitinase, CHT)活性，多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)活性和β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-glucanase, β-1,3-GA)活性测定采用酶联免疫试剂盒测定，具体测定方法参照Gao等[19]。

1.4 数据统计与分析

试验数据运用软件Excel 2016进行作图分析，并结合软件SPSS 19.0进行方差分析、Pearson相关性分析和检验的差异分析。

2 结果与分析

2.1 灰霉菌对月季防御酶活性及合成相关基因的表达分析

受到病原菌侵染后植物会产生一系列的防御反应，因此在0、36、60和72 h时分别对接种灰霉菌的月季花器官的防御酶PPO、CHT、POD、SOD和GLU的酶活性进行测定。结果发现，PPO、GLU和POD活性在病原菌侵染过程中持续显著升高，在36、60和72 h 时PPO活性分别提升了5.72%，41.87%，59.66%；GLU活性分别提升78.65%，86.86%，88.92%；POD活性分别提升了26.13%，51.35%，55.86%；CHT活性在月季感染灰霉菌60 h后显著升高，在60和72 h分别提升了17.9%和24.65%；SOD活性呈现持续显著下降的趋势，在36、60和72 h分别下降了37.18%，39.64%，56.65%(图1)。

所有统计分析均采用Studen’s t-检验，同一小幅图中不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，下同

为了阐明月季抗灰霉菌的分子基础，对感染灰霉菌的月季花器官PPO、POD和GLU合成相关基因RcPPO，RcPOD和RcBGLU的表达量进行了分析(图2)，结果RcPPO，RcPOD和RcBGLU基因的表达量均显著增高，表明灰霉菌的侵染激活了月季体内抗性相关酶合成基因的表达。

图2 灰霉菌胁迫下月季花器官RcPPO，RcPOD和RcBGLU基因表达量分析

2.2 外源激素对灰霉菌侵染的月季花器官酶活性的影响

为了进一步探究月季对灰霉菌的抗病机制，利用外源JA、SA、ABA、ET和BR作为诱导剂对月季感染灰霉病不同时间点的防御酶活性进行测定。

SOD活性：与对照比较，SA和ACC处理后月季花器官SOD活性显著升高，随着接种灰霉菌时间延长，SA和ABA处理SOD活性在36、60和72 h时均显著低于对照；ACC处理的花器官在接种灰霉菌36、60和72 h时其SOD活性在无显著差异；JA处理的花器官，在接种灰霉菌72 h时其SOD活性显著升高；BR处理的花器官，其SOD活性随着灰霉菌侵染时间的延长在36、60和72 h时均显著高于对照；处理两两比较发现，JA处理和BR处理后，随着灰霉菌侵染时间的延长花器官SOD活性在36、60和72 h时均显著高于其他处理(图3)。由此可知，外施JA和BR可显著提高灰霉菌胁迫下月季花器官的SOD活性。

图3 灰霉菌胁迫下外源激素处理月季花器官SOD酶活性变化

GLU活性：ABA处理后月季花器官在灰霉菌侵染36 h的GLU活性最高，显著高于对照，灰霉菌侵染72 h 的GLU活性显著低于对照，表明在灰霉菌胁迫下ABA处理只能在一段时间内提高月季花器官的GLU活性，随着侵染时间的延长GLU活性逐渐降低；JA和ACC处理的花器官GLU活性在灰霉菌胁迫0、36、60和72 h持续显著升高，且均显著高于对照；SA处理的花器官在灰霉菌胁迫过程中均显著高于对照，在60 h其GLU活性最高；BR处理的花器官在灰霉菌胁迫60和72 h时，其GLU活性均显著高于对照；处理组两两比较发现，BR、SA、JA和ACC处理的花器官在灰霉菌胁迫下GLU活性均显著提高(图4)。由此可知，外源BR、SA、JA和ACC处理能够显著提高月季花器官在灰霉菌胁迫下的GLU活性。

图4 灰霉菌胁迫下外源激素处理月季花器官GLU酶活性变化

PPO活性：ABA处理的花器官在灰霉菌胁迫36和60 h时其PPO活性显著高于对照，灰霉菌胁迫72 h 时其PPO活性下降显著低于对照组，呈先上升后下降的趋势；BR、SA、JA和ACC处理的花器官在灰霉菌胁迫36、60和72 h时的PPO活性均显著高于对照；处理两两比较发现，灰霉菌胁迫60 h时，BR处理的花器官的PPO活性显著高于其他处理的PPO活性，随着灰霉菌胁迫时间的延长，JA处理的花器官的PPO活性显著高于其他处理组，表明在灰霉菌胁迫下，外源BR和JA能够持续提高月季花器官的PPO活性(图5)。推断外源BR、SA、JA和ACC能在一定程度上通过提高月季PPO活性增强其对灰霉菌的抗性，BR和JA处理的效果要优于另外3种激素处理。

图5 灰霉菌胁迫下外源激素处理月季花器官PPO酶活性变化

POD活性：ABA处理的花器官在灰霉菌侵染36、60和72 h其POD活性均显著高于对照，且POD活性变化趋势与对照一致均呈持续显著增高的趋势；JA处理后POD活性与对照无显著差异；BR、SA和ACC处理的花器官在灰霉菌胁迫下，POD活性呈先上升后下降的趋势，BR和ACC处理的花器官的POD活性在60 h最高与对照无显著差异，灰霉菌侵染72 h时其POD活性均显著低于对照，表明外源BR和ACC处理不能影响花器官在灰霉菌胁迫下的POD活性；SA处理的花器官在灰霉菌胁迫36 h时POD活性最高，并显著高于对照，灰霉菌侵染60 h与对照无显著差异，灰霉菌侵染72 h其POD活性显著低于对照组，因此推断外源SA处理在短时间内提高花器官在灰霉菌胁迫下的POD活性具有一定的效果，但随着时间的延长效果并不显著；处理两两比较，ABA处理的花器官在灰霉菌胁迫下其POD活性显著高于其他外源激素处理(图6)，表明外源ABA处理能够持续增强月季对灰霉菌防御过程中POD活性。

图6 灰霉菌胁迫下外源激素处理月季花器官POD变化

CHT活性：ABA处理的花器官在接种0和36 h时的CHT活性显著提高；BR处理的花器官在灰霉菌胁迫60 h时的CHT活性显著高于对照；SA处理的花器官在灰霉菌胁迫36 h时的CHT活性达到最高，随后CHT活性下降，在72 h显著低于对照；JA处理的花器官在灰霉菌胁迫过程中其CHT活性与对照组无显著差异；ACC处理的花器官在灰霉菌胁迫过程中其CHT活性均显著高于对照；处理两两比较，ACC处理的花器官在灰霉菌胁迫过程中CHT活性显著高于其他处理(图7)，表明外源ACC处理能够提高月季在灰霉菌侵染过程中的CHT活性，推断外施ACC能够在一定程度上提高月季对灰霉菌的抗性。

图7 灰霉菌胁迫下外源激素处理月季花器官CHT变化

2.3 生理生化指标间方差分析和相关性分析

利用Pearson相关系数法分析月季花器官不同生理生化指标间的相关性，如表1所示。本研究中月季花器官氧化酶SOD和POD呈负相关，即SOD活性下降，POD活性上升，表明在灰霉菌胁迫下，其SOD抗氧化系统可能被破坏，POD活性上升以降低灰霉菌对月季花器官的伤害。GLU和CHT能够降解病原菌的细胞壁和抑制其繁殖能力降低其对植物器官的侵害，PPO通过催化木质素和醌类化合物的合成增强植物对病菌的防御能力。在本研究中，3种抗病酶PPO、GLU和CHT呈正相关，通过共同作用增强了月季花器官对灰霉菌的抵抗能力。

表1 酶活性相关性分析

3 讨 论

植物在受到病原菌侵染后，会诱导体内一系列防御酶活性的变化，PPO、POD、SOD、GLU和CHT在植物抵抗病原菌侵染过程中具有重要的作用，其活性变化可以作为植物防御能力的指标之一。SOD和POD共同作用能够清除细胞内自由基活性氧，将有毒的自由基氧化还原成H2O2和O2。PPO通过催化植物中木质素合成，构成保护性屏障而使细胞免受病原菌的侵害，也可通过形成醌类化合物直接发挥抗病作用。GLU和CHT通过破坏并抑制真菌的致病力和孢子萌发提高植物的抗菌能力[21-22]。单羽等研究表明，水稻幼苗受到碱蓬内生菌侵染后会导致其POD活性增强[23]。田丽波等[24]研究表明，不同苦瓜品系在受到白粉病菌侵染后其防御酶(PPO、SOD和POD)活性被诱导大幅提升。欧秀玲等[25]研究表明，棉花在受到黄萎病病原菌侵染后，其体内CHT和GLU活性会发生变化。本研究发现，月季花器官感染灰霉菌后其PPO、POD、GLU、CHT活性呈持续升高的趋势，SOD酶活性呈持续显著下降的趋势，推断灰霉菌的侵染可能使月季花器官SOD抗氧化系统被破坏。SOD活性下降与百合对灰霉菌的响应呈相反的趋势[26]。以上结果表明，灰霉菌诱导了月季体内抗病酶活性，其抗氧化相关酶POD持续上升以平衡其氧化和抗氧化系统。

植物激素广泛调节植物对病虫害的抗性反应。通常当植物遭受逆境胁迫时体内活性氧自由基积累，细胞内一些保护酶系统活性增强，以清除过多的活性氧自由基，从而增强植物的抗逆性[27]。苏岳峰等[28]研究发现，利用外源JA和SA处理胡椒能够增强在感染辣椒疫霉菌后POD和SOD活性进而增强对辣椒疫霉菌的抗性。左豫虎等[29]研究表明大豆CHT和GLU活性的增强与其对大豆疫霉菌的抗性呈正相关。根据本研究结果推断，ABA和SA可能参与月季在灰霉菌胁迫下的氧化与抗氧化平衡的过程。JA、BR和ACC则通过直接诱导其抗病酶活性减缓灰霉菌孢子的繁殖和提高其体内抗菌物质和自身的物理屏障增强月季对灰霉菌的抗性。以上可知，外施JA，BR和ACC能够更好的增强月季对灰霉菌的抗性。

4 结 论

通过对感染灰霉菌后月季花器官的生理变化测定表明灰霉菌诱导了月季花器官内PPO、GLU、CHT和POD 4种酶活性的提升，SOD活性的下降，且诱导了RcPPO，RcPOD和RcBGLU3个抗病酶相关基因的表达量显著升高。外源ABA和SA与月季花器官内抗氧化相关酶活性息息相关，外源ACC、JA和BR则通过直接诱导月季花器官内抗病相关酶活性提升增强对病原菌的抗性。本研究为今后研究月季花器官对灰霉菌的抗性机制和防治方法提供了理论基础。