鮟鱇鱼、鱿鱼、马面鱼明胶提取工艺优化

区兑鹏，张小军，严忠雍，郑 斌

(1 浙江海洋大学食品与医药学院，浙江 舟山，316022；2 浙江省海洋水产研究所，浙江 舟山，316022)

鮟鱇鱼一般生活在海平面以下200～500 m的海底深处，属硬骨鱼类，胺鳙目、鮫鳙科，为近海底层肉食性鱼类，中国沿海均有产[1]。鱿鱼，也称柔鱼、枪乌贼，是软体动物门头足纲鞘亚纲十腕总目管鱿目开眼亚目的动物，常成群游弋于深约20 m的海洋中[2]。马面鱼俗名橡皮鱼、剥皮鱼，中国东海、黄海均有分布，属于外海近底层鱼类[3]。在鱼类加工带来的废料当中，鱼皮占到了总量的40%～55%[4]。这3种海洋鱼类在销售及食用过程中，均会进行去皮处理，去除的鱼皮变成了加工废弃物，因此，需要进行二次加工处理，使其变废为宝[5]。王锡念等[6]通过超声波辅助酶解提取鮟鱅鱼皮胶原蛋白，胶原蛋白提取率(3.25±0.68)%。马华威等[7]对鮟鱇鱼皮进行了酶溶性胶原蛋白对自由基的清除作用实验，显示该胶原蛋白具有体内外清除自由基作用。李琳等[8]利用酶工程技术，以鱿鱼为主要的利用对象，通过选择适宜的蛋白酶和控制酶解过程，研究开发水产胶原蛋白及其家聚肽制品，但明胶提取还是少数。宋正规等[9]以马面鱼皮为原料，优化胃蛋白酶提取马面鱼皮胶原蛋白工艺，并对所提胶原蛋白进行结构分析。

鱼皮明胶是鱼皮经过适度水解及热变性后所得到的功能性生物聚合物，其氨基酸含量极高，目前在诸多食品领域均有分布[10]。从牛羊等畜类提取的明胶会携带传染性海绵状脑病毒、猪瘟病毒；禽类提取的明胶会携带甲型流感等病毒[11]。而从鱼皮中提取明胶能够提供一个可接受的、替代原来禽畜来源的产品[12]。与禽畜类明胶相比，鱼皮明胶的胶凝和熔化温度更低，同时在熔化过程中还展现出了高聚物特征[13]。明胶的产量和品质不仅受原料组织提取工艺的制约，而且还取决于pH、预处理、提取温度和提取时间[14]。目前普遍采用酸法、碱法、酸盐法及盐碱法来处理明胶。其原理为借助酸、碱、酶处理，使得胶原纤维分子间与分子内的共价交联及非共价键受到破坏，使得胶原分子被释放，再借助加热，断裂胶原螺旋氢键，最终释放明胶[15]。热水提胶时，水分子融入胶原分子链间隙，保证胶原分子三链螺旋架构的次级键氢键断裂，而加热能够提升这一过程的效率，让胶原成为明胶[16]。酸法提取能最大限度地保持其三股螺旋结构，但产品得率较低[17]；碱法迅速且彻底，但含羟基和巯基的氨基酸全部被破坏且产生消旋作用(结构变异)[18]。

本研究以酶处理后，再经过热水法提取，对鮟鱇鱼、鱿鱼、马面鱼3种鱼皮进行明胶提取优化试验，没有采取一贯前处理和提取工艺分开优化，而是连接了前处理及提取阶段合并优化，以降低处理时间并提高明胶得率，为明胶后续特性研究建立良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

鱿鱼皮(中国水产舟山海洋渔业有限公司)、鮟鱇鱼皮(中国水产舟山海洋渔业有限公司)、马面鱼皮(舟山国际水产交易市场)；NaOH、木瓜蛋白酶(50 000 U/g)、胰蛋白酶(3 800 U/mg)、中性蛋白酶(50 000 U/g)、胃蛋白酶(30 000 U/g)。

1.2 仪器与设备

DF-101S恒温磁力搅拌器(邦西仪器科技(上海)有限公司)、HH-S11.6数显恒温水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司)、Avanti JXN-30离心机(美国Beckman Coulter公司)、SCIENTZ-10N冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，羟脯氨酸试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 方法

1.3.1 鱼皮明胶制备

将购买的鱼皮用水进行清洗，除去血水及杂质，称取一定量鱼皮在烧杯内，以1∶4(W∶V)加入0.05%的NaOH溶液，并使用磁力搅拌器搅拌1 h，使鱼皮除去油脂的同时能够充分膨胀。转入50 mL离心管5 000 r/min离心5 min，离心半径为10 cm，弃去上清液，下层鱼皮使用蒸馏水漂洗至中性，加入酶，在适宜的温度下进行酶解。当鱼皮被完全酶解后进行8 000 r/min离心5 min，离心半径为14 cm，取上清液在适宜的提胶温度下进行明胶提取、浓缩，取浓缩液15 mL进行冷冻干燥。

1.3.2 单因素试验设计

酶种类中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶；酶添加量，底物量的0.4%～0.8%；酶解时间1～3 h；酶解温度，30 ℃、35℃、40℃；提胶时间1～3 h；提胶温度(60℃、65℃、70℃、75℃)。设置基本条件为中性蛋白酶、酶添加量0.6%、酶解时间2 h、酶解温度35℃、提胶时间2 h、提胶温度70℃。以明胶得率为指标，进行3次平行试验。

1.3.3 响应面试验设计

以单因素试验为前提，以明胶得率为响应值，测定羟脯氨酸含量。对影响明胶得率的前处理条件及提胶条件作5因素3水平响应面优化分析，结果均以Design-Expert 8.0软件分析。获取提取最佳工艺参数。因素水平的具体参数见表1。

表1 响应面实验设计因素与水平

1.3.4 明胶得率计算

(1)

式中：X1明胶得率，%；W1—鱼皮明胶干粉质量，g；W2—鱼皮湿质量，g。

1.3.5 明胶羟脯氨酸含量基酸

采用羟脯氨酸试剂盒，对3种鱼皮明胶的羟脯氨酸含量进行试验。①取1 g明胶样品到试管中并加入1 mL蒸馏水，准确加入水解液1 mL加盖后95℃沸水浴水解20 min。②流水冷却后加入指示剂10 mL，摇匀。③各管准确加入调节pH甲液1 mL，混匀(此时溶液应为红色)。④在涡旋仪上逐滴加入pH调节乙液，直至液体中指示剂颜色为黄绿色。⑤加入蒸馏水10 mL，混匀。⑥取3～4 mL加适量活性炭，混匀，3 500 r/min离心10 min，用注射器吸取1 mL于波长550 nm，1 cm光径，蒸馏水调零，测定各管吸光值。计算公式如下：

(2)

式中：X2羟脯氨酸含量，μg/mg干重；A0空白OD值；A1标准OD值；A2测定OD值；B标准品含量(默认5)，μg/mL；C水解液总体积，mL；D组织干质量，mg。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶的种类对明胶得率的影响

酶种类对明胶得率的影响如图1所示。

图1 酶的种类对明胶得率的影响

酶的特异性使其与底物作用的位点存在差异性，酶解得到胶原肽的数量和明胶被水解的程度不同[19]。由图1可知，对3种鱼皮使用3种蛋白酶酶解，中性蛋白酶的明胶得率均远高于其他两种蛋白酶，相较于其他2种酶经过木瓜蛋白酶处理所得明胶最低。这与李剑瑛等[20]所做的赤魟鱼鱼皮胶原肽提取结果相似，均为中性蛋白酶>胰蛋白酶>木瓜蛋白酶。

2.1.2 酶的添加量对明胶得率的影响

酶添加量对明胶得率的影响如图2所示。

图2 酶的添加量对明胶得率的影响

针对相异鱼皮，酶添加量过多，会使得胶原水解程度过大，大分子亚基产生次级降解，无法取得较高的明胶得率[21]；其次随着酶添加量的增多，反应速率加快，当酶的添加量到一定质量浓度时，反应开始下降，说明酶与底物反应充分，此时反应速率与酶添加量无关，产物质量浓度的增大对提取率会有一定的抑制作用[22]。由图2可知，鮟鱇鱼在酶添加量为0.7%时明胶得率最高，为12.491%，在鱿鱼中，添加量从0.4%到0.8%明胶得相对平稳，维持在6%之间，但相比之下，当酶添加量在0.5%时明胶得率最高，为6.856%。马面鱼在酶添加量为0.6%时，明胶产率最高，为5.317%。

2.1.2 酶解时间及温度对明胶得率的影响

酶解时间及温度对明胶得率的影响如图3所示。

图3 酶解时间及温度对明胶得率的影响

由图3可知，随着温度及时间的增加，鮟鱇鱼和鱿鱼的明胶得率在40℃/2h时最高，分别为15.108%、11.555%。而马面鱼在30℃/1h时明胶的率最高，为6.413%。对于鮟鱇鱼和鱿鱼而言，可能是因为随着温度的上升，酶的活性逐渐升高，酶解效率逐渐增高，当达到一定程度后，随着温度的升高蛋白酶变性导致酶活下降，酶解效率从而逐渐下降[23]。而马面鱼酶处理最佳因素在30℃/1h，说明马面鱼酶处理最优条件在30℃/1h附近，也说明了对不同的底物，最优酶解温度是有区别的，只有达到这一最优温度，才能避免酶解不充分及过度的情况；处理时间过低 原料中非螺旋结晶区、非共价交联键并未得到很好的破坏，无法取得较高的明胶得率[24]；如果处理时间太长，也会使得胶原水解程度过大，同样难以获取较高的明胶得率[25]。

2.1.3 提胶时间及温度对明胶得率的影响

图4所示，在温度低时，氢键、分子间静电等作用力被破坏，随之导致一些胶原螺旋结构解体，明胶中某些大分子组成，例如亚基结构，溶出量减少[26]。随着温度升高，能够让已被破坏的胶原化学键数量提升，胶原解体速度、程度均加快，更多的亚基组分被释放，从而明胶凝胶强度增加[27]。然而需要注意的是，假设温度太高，大分子物质会被降解为次级产物，胶凝胶强度会呈下降趋势[28]。处于75℃/1h时，鮟鱇鱼和鱿鱼明胶得率最高，分别为13.921%、9.612%。而马面鱼提胶条件在65℃/2h时，明胶得率最高，为5.152%。

图4 提胶时间及温度对明胶得率的影响

2.1.4 单因素条件确定

对于3种不同鱼类的鱼皮，鱿鱼水分含量高、马面鱼水分含量少，而鮟鱇鱼水分含量介于两者之间，经NaOH处理后，使鱼皮去腥除杂的同时，和胶原蛋白分子碱性基团融合[29]；断裂分子内或分子间离子键、氢键，释放出明胶原分子，并且让鱼皮体积更大，松散度提升，为之后的提胶提供便利[30]。在经NaOH处理过程中，鮟鱇鱼、鱿鱼得到充分膨胀，而马面鱼由于本身含水量较低，膨胀现象并没有其他两种鱼皮明显，这导致经酶解提胶处理后，马面鱼明胶得率非常低，从整体上看明胶得率鮟鱇鱼>鱿鱼>马面鱼。由于中性蛋白酶对3种鱼皮处理的明胶产率远高于其他两种酶，因此在响应面优化中选择中性蛋白酶进行后续试验。表2为3种鱼皮单因素最优条件，于该前提下作响应面优化试验设计。

表2 单因素最优条件

2.2 响应面法优化3种鱼皮明胶提取工艺

2.2.1 响应面模型建立及回归方差分析

综合分析单因素试验结果后，选择中性蛋白酶，酶添加量为0.5%、0.6%、0.7%。鮟鱇鱼和鱿鱼的选取条件一致：酶解温度选择38、40、42℃，酶解时间1.5、2、2.5 h，提胶温度选取73、75、77℃，提胶时间0.5、1、1.5 h。马面鱼酶解温度选取28、30、32℃，酶解时间0.5、1、1.5 h，提胶温度选取63、65、67℃，提胶时间0.5、1、1.5 h。以明胶得率为响应值，结果见表3。其中A为酶添加量、B为酶解时间、C为酶解温度、D为提胶时间、E为提胶温度、X1为明胶得率、X2为羟脯氨酸含量。

利用Design-Expert 8.0软件对上述试验结果进行二次回归拟合，得到3种鱼皮明胶得率的二次回归方程。

3种鱼F值分别为12.8104、20.4914、25.782 0，P均小于0.000 1，表明该模型极其显著，二次模型失拟项分别为F=2.365 8、P=0.426 5；F=1.276 3、P=0.426 5；F=0.812 5、P=0.668 4均不显著，说明3种鱼皮明胶得率模型可接受，可用于评估变量参数对明胶得率的影响。多元关系分别为R2=0.911 1、R2=0.942 5、R2=0.953 8，说明该模型可用于3种鱼皮明胶工艺参数的预测与优化。

在回归模型的5个影响因素中，提胶温度对3种鱼皮明胶提取率的影响最大(鮟鱇鱼：0.890 3、鱿鱼：54.071 5、马面鱼：22.239 3)。鮟鱇鱼皮明胶二次项A2、B2、C2、D2、E2，鱿鱼皮明胶二次项A2、B2、D2、E2，马面鱼皮明胶二次项A2、C2、E2均达到及其显著水平(P<0.01)；鱿鱼皮及马面鱼皮明胶一次项E呈极其显著水平(P<0.01)，即提胶温度对鱿鱼皮及马面鱼皮明胶提取有显著影响；证明不同要素对3种鱼皮明胶得率影响，并非单纯的线性关系。

表3 响应面试验设计与结果

2.2.2 响应面各因素交互作用分析

为了更好、更直观地了解各因素交互情况下对各指标的影响情况，根据回归模型方差分析所得数据得出相应的响应面交互图，并研究了酶添加量、酶解温度及时间、提胶温度及时间对3种鱼皮明胶提取率的交互影响。响应面图可以体现两要素间相互作用关系[31]，3D图里，曲面倾斜度与坡地陡度和两要素间交互作用呈正向关联；另外，借助等高线图，能够相当显著地看出要素间交互显著度，假设其为圆形，则代表缺乏明显交互作用，假设为椭圆形，则代表拥有明显交互作用。

由图5～8的3D图和等高线平面图可看出，与温度有关的3D图更陡，椭圆形呈现较好，等高线更密集。说明无论前处理还是提胶过程，提取温度对3种鱼皮明胶提取的影响是最大的，这与二次回归模型方程结果一致。

图5 酶添加量和提胶温度分别对3种鱼皮明胶得率交互影响的响应面与等高线图

图6 酶解时间和提胶温度分别对3种鱼皮明胶得率交互影响的响应面与等高线图

图7 酶解温度和提胶温度分别对3种鱼皮明胶得率交互影响的响应面与等高线图

图8 提胶时间和提胶温度分别对3种鱼皮明胶得率交互影响的响应面与等高线图

基于上面对3种鱼皮明胶响应面交互分析后可知，在明胶得率影响要素方面，温度的影响最大。因为借助酶预处理，使得稳定胶原纤维分子间与分子内的共价交联及非共价键遭破坏，最大限度地释放原胶原分子[32]。在温度影响下，使得明胶间的交联键被削弱，从而使胶原变成了溶于水的明胶[33]。

由于明胶提取涉及前处理与提胶2个步骤，由3种鱼皮明胶提取响应面交互分析可知，前处理(酶解处理)步骤或提胶步骤内所呈现的等高线图，椭圆形呈现更好。而前处理步骤与其后的提胶过程有些因素交互并不是很好，例如酶添加量与提胶时间、酶解温度与提胶时间，等高线图近乎呈现圆形，说明生产明胶的两个步骤既相互独立又有所关联，但前处理步骤或提胶步骤内对明胶影响更大。酶解和提胶时间响应面交互图里，坡度平缓，即酶解时间、提胶时间两者交互对鱼皮明胶提取影响不大，但在明胶提取的两个步骤中扮演着不可或缺的因素。

羟脯氨酸是典型的明胶特征性的一种氨基酸[34]，其含量取决于明胶原料，相异种类明胶里，其含量并不一致。据表3得，当明胶产率高时，羟脯氨酸的含量也高，即羟脯氨酸含量与3种鱼皮明胶产率近似成正比的关系。并且水产胶原蛋白的热稳定性也与羟脯氨酸含量成正比[35]。有研究表明生活在低温环境中的生物，胶原蛋白中脯氨酸的羟基化程度较低[36]。

2.2.3 验证试验

软件模拟的最优方案见表4，鮟鱇鱼皮、鱿鱼皮明胶提取最优工艺均为：酶添加量0.6%、酶解时间2 h，酶解温度40℃、提胶时间1 h、提胶温度75℃；马面鱼皮明胶提取最优工艺：酶添加量0.6%、酶解时间1 h，酶解温度30℃、提胶时间2 h、提胶温度65℃。

表4 Design-Expert 8.0软件模拟最佳工艺及验证试验值

使用最优工艺进行3类鱼皮明胶提取试验，并重复3次。鮟鱇鱼皮明胶得率24.598%；鱿鱼皮明胶得率20.807%；马面鱼皮明胶得率11.227%。由结果可看出3种鱼皮明胶得率均优于软件预测值，说明响应面优化3种鱼皮明胶得率试验具有实际参考意义。

3 结论

经过响应面分析发现，酶解温度及提胶温度对这3种海洋鱼类鱼皮明胶提取率影响最大，不同因素对3种鱼皮明胶得率影响，并非单纯的线性关系。且当明胶产率高时，羟脯氨酸的含量相应的较高，即羟脯氨酸含量与3种鱼皮明胶产率近似成正比的关系。通过优化明胶提取工艺，鮟鱇鱼明胶得率为24.598%，鱿鱼明胶得率为20.807%，马面鱼皮明胶提取率为11.227%。

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