亲环素A在人卵巢癌组织中表达情况及临床意义

严京哲， 梁衍涛， 袁 勇， 周 莉

吉林省肿瘤医院1.腹部肿瘤二科；2.骨及软组织肿瘤外科；3.妇瘤二科，吉林 长春 130021

卵巢癌是常见的女性生殖器官恶性肿瘤，因卵巢位于盆腔深部，早期病变不易被发现，多数患者出现症状时已处于晚期。卵巢上皮性癌病死率居妇科恶性肿瘤第1位[1]。因此，寻找特异性的卵巢癌治疗及预后标志物有助于卵巢癌的早期诊治，进而改善患者预后。亲环素A(Cyclophilin A，CypA)是免疫抑制剂环孢霉素A在细胞内的作用靶点[2-3]。有研究表明，多种实质性肿瘤组织中CypA蛋白均高表达[4-8]；而卵巢癌与CypA蛋白相关性的研究较少。因此，本研究通过手术切除人卵巢癌组织标本，采用免疫组化法分析人卵巢癌组织中CypA蛋白表达与其病理分级、临床分期及预后的相关性，探讨CypA蛋白作为辅助标志物诊断人卵巢癌的可行性。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 选取吉林省肿瘤医院自2000年1月至2012年12月收治的37例接受妇科手术切除并病理证实为卵巢癌的患者为研究对象。卵巢癌患者年龄32～71岁，平均年龄(47.3±8.8)岁；病理分级高(G1级)、中分化(G2级)13例，低分化(G3级)24例；临床分期Ⅰ/Ⅱ期15例，Ⅲ/Ⅳ期22例；均为初发，且术前未接受过放化疗。收集卵巢癌患者的卵巢癌组织。另选取同期10例接受妇科子宫肌瘤手术的患者作为对照。子宫肌瘤患者年龄36～60岁，平均年龄(46.0±8.2)岁。收集子宫肌瘤患者的正常卵巢组织。患者及家属均知情同意。本研究经医院伦理委员会批准。组织标本甲醛40 g/L固定，石蜡包埋，连续切片，厚度约5 μm。DAB、ABC复合物、羊抗兔二抗购自Vector公司，兔抗人CypA多克隆抗体ab41684购自abcam公司。

1.2 实验方法 (1)常规脱蜡、水化切片；(2)用pH 6.0的枸橼酸钠缓冲溶液0.01 mol/L抗原修复1～2次；(3)用含H2O230 ml/L的甲醇800 ml/L室温条件下封闭切片20 min，目的在于消除内源性过氧化物酶的影响；(4)用PBS溶液0.01 mol/L清洗3次，每次清洗时间5 min，加入0.3% Triton X-100，置于室温条件下孵育30 min，目的在于提高细胞的通透性；(5)用PBS溶液0.01 mol/L清洗3次，每次清洗时间5 min，加入CypA多克隆抗体(1∶200)，置于4℃条件下24 h；(6)用PBS溶液0.01 mol/L清洗3次，每次清洗时间5 min，加入二抗(1∶400)，置于室温条件下孵育2 h；(7)用PBS溶液0.01 mol/L清洗3次，每次清洗时间5 min，加入ABC复合物(1∶400)，置于室温条件下孵育2 h；(8)用PBS溶液0.01 mol/L清洗3次，每次清洗时间5 min，用蒸馏水迅速冲3次，然后再加入DAB-H2O2显色3 min，苏木精复染，脱水、封片。将PBS溶液0.01 mol/L代替一抗作空白对照。

1.3 结果判定 CypA蛋白表达结果判定：阳性细胞为细胞有棕褐色、棕色、浅黄色颗粒；以阳性颗粒定位好，细胞结构清洗、着色与背景对比清晰为阳性染色细胞条件。观察5个(400倍)高倍视野阳性细胞所占比例，其中，(-)表示阳性细胞数<1%或无阳性细胞，(+)表示阳性细胞数1%～10%，(++)表示阳性细胞数11%～50%，(+++)表示阳性细胞数>50%。

1.4 随访 采用信访和电话随访方式，于患者手术之日开始，随访至2013年6月。统计资料除外随访期内死于卵巢癌以外原因或术后3个月内死亡者。记录患者生存时间。

2 结果

2.1 CypA蛋白表达情况 子宫肌瘤患者的正常卵巢组织CypA蛋白阴性表达(图1a)；病理分级G1～G2级卵巢癌细胞胞质有棕黄色细颗粒，染色淡，阳性细胞少(图1b)；病理分级G3级卵巢癌细胞阳性细胞多，且胞质棕黄色着色较深(图1c)。37例卵巢癌组织中，CypA蛋白表达22例，阳性率为59.5%(22/37)；10例正常卵巢组织中，CypA蛋白表达0例，阳性率为0(0)。卵巢癌组织CypA蛋白表达阳性率明显高于正常卵巢组织，差异有统计学意义(P<0.05)。CypA蛋白表达22例患者中：(1)病理分级G1～G2级4例，阳性率为30.8%(4/13)；病理分级G3级18例，阳性率为75.0%(18/24)。G3级卵巢癌组织CypA蛋白表达阳性率明显高于G1～G2级卵巢癌组织，差异有统计学意义(P<0.05)。(2)临床分期Ⅰ/Ⅱ期5例，阳性率为33.3%(5/15)；临床分期Ⅲ/Ⅳ期17例，阳性率为77.3%(17/22)。Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌组织CypA蛋白表达阳性率明显高于Ⅰ/Ⅱ期卵巢癌组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 卵巢组织CypA蛋白表达情况[a.正常卵巢组织，CypA蛋白表达阴性，200倍；b.人卵巢癌病理分级G1级组织，CypA蛋白表达弱阳性(+)，400倍；c.人卵巢癌病理分级G3级组织，CypA蛋白表达强阳性(+++)，400倍]

2.2 CypA蛋白在人卵巢癌组织中表达强度与预后相关性 37例卵巢癌患者平均随访43.54个月(3～87个月)。15例患者CypA蛋白表达阴性(-)，7例患者弱阳性(+)，6例患者中度阳性(++)，9例患者强阳性(+++)。CypA蛋白表达阴性(-)患者平均生存时间(62.55±14.32)个月，弱阳性(+)(44.29±13.33)个月，中度阳性(++)(31.83±7.78)个月，强阳性(+++)(19.11±10.79)个月，组间两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。CypA蛋白表达强度与患者生存时间呈负相关(r=-0.792，P<0.05)。

3 讨论

有研究报道，CypA蛋白在胰腺癌[4]、肺癌[5-6]、大肠癌[7]等多种肿瘤细胞中高表达，与肿瘤发生发展具有相关性。多项研究证实，癌组织中CypA蛋白表达增高，在子宫内膜癌和胰腺癌中，CypA的表达与病理分级、预后密切相关[8-9]。本课题组既往研究发现，胰腺癌组织中CypA蛋白的表达在胰腺癌的生长、侵润、转移中发挥重要作用[10-11]。

本研究结果显示：CypA蛋白在正常卵巢组织中表达阴性，而在人卵巢癌组织中表达阳性率高，主要为胞浆着色；卵巢癌组织CypA蛋白表达阳性率高于正常卵巢组织，病理分级G3级卵巢癌组织CypA蛋白表达阳性率高于G1～G2级卵巢癌组织，临床分期Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌组织CypA蛋白表达阳性率高于Ⅰ/Ⅱ期卵巢癌组织，差异有统计学意义(P<0.05)；CypA蛋白表达强度与患者生存时间呈负相关(r=-0.792，P<0.05)。即随着卵巢癌恶性程度增长，CypA蛋白表达水平呈升高趋势，不同病理级别、临床分期卵巢癌组织的CypA蛋白表达差异明显，且CypA蛋白表达与患者生存时间密切相关。这提示，人卵巢癌组织中CypA蛋白的表达可反映卵巢癌的病理级别、临床分期及预后等因素，CypA蛋白表达水平可以作为判断人卵巢癌恶性程度的指标之一。

综上所述，人卵巢癌组织中CypA蛋白的表达强度与肿瘤的恶性程度及预后相关，检测CypA蛋白表达对于判断人卵巢癌的性质和预后具有一定价值，其可能为癌症治疗方式的发展提供新的药物靶点。