针刺对胶原诱导性关节炎大鼠胃肠动力的影响

谈倩 李佳 李静 李柏村 向宏春 蔡国伟

摘要 目的：利用制备的胶原诱导性關节炎（CIA）大鼠模型，探讨针刺足三里对CIA大鼠胃肠动力的影响。方法：将60只12周龄雄性大鼠随机分为4组：正常组、模型组、电针组、手针组，每组15只，建立牛Ⅱ型胶原与不完全弗氏佐剂诱导CIA大鼠模型。电针组和手针组于造模完成后第1天取足三里穴治疗，15 min/次，1次/d，连续治疗14 d。在3 d，7 d，14 d时，采用跖围法测大鼠跖围长度，并在治疗14 d后，用苏木精-伊红（HE）染色观察膝关节的病理学变化，计算大鼠的胃排空率和肠推进率，结肠蠕动波测定方法检测大鼠的肠蠕动波次数，通过蛋白质免疫印迹法检测胃黏膜中促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）和血管活性肠肽（VIP）的表达。结果：与正常组比较，模型组大鼠跖关节肿胀明显（ P <0.01），软骨组织破坏严重并有炎症细胞浸润，胃排空率和肠推进率均降低（ P <0.01），胃黏膜中CRF和VIP表达明显增多（ P <0.01）。与模型组比较，针刺后大鼠跖关节肿胀程度明显降低（ P <0.05），软骨破坏程度减轻和炎症细胞浸润明显减少，胃排空率和肠推进率提升（ P <0.05），肠蠕动波次数增加，胃黏膜中CRF和VIP表达量减少（ P <0.05），其中手针干预效果最为显著。结论：针刺足三里对CIA大鼠的肠动力障碍具有调节作用，并且手针组疗效优于电针组治疗。

关键词 针刺;手针;足三里;类风湿关节炎;胃肠动力;内脏敏感性;促肾上腺皮质激素释放因子;血管活性肠肽

Effect of Acupuncture at Zusanli（ST 36） on Gastrointestinal Motility in Rats with Collagen-induced Arthritis

TAN Qian1，LI Jia2，LI Jing1，LI Bocun1，XIANG Hongchun1，CAI Guowei1

（1 Department of Acupuncture and Moxibustion，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China; 2 Hubei Provincial Collaborative Innovation Center of Preventive Treatment by Acupuncture and Moxibustion，College of Acupuncture and Orthopedics，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430061，China）

AbstractObjective： To investigate the effect of acupuncture at Zusanli（ST 36） on gastrointestinal motility in the rats with collagen-induced arthritis（CIA）. Methods： Sixty healthy Sprague-Dawley（SD） rats aged 3 months were randomly assigned into four groups：normal group，model group，electroacupuncture group，and hand acupuncture group，with 15 rats in each group.Electroacupuncture and hand acupuncture were respectively carried out at Zusanli（ST 36） for 15 min once a day for 14 days since the first day after modeling.On days 3，7，and 14，plantar circumference of each rat was measured.At the end of treatment，the pathological changes of knee joints were observed by hematoxylin-eosin（HE） staining.The gastric emptying rate and intestinal propulsion rate were calculated，and the frequency of peristaltic waves in intestine was detected.The expression of corticotropin-releasing factor（CRF） and vasoactive intestinal peptide（VIP） in gastric mucosa was measured. Results： Compared with the normal group，the modeling caused the swelling of plantar joint（ P <0.01），severe damage of cartilage tissue，and infiltration of inflammatory cells，decreased the gastric emptying rate and intestinal propulsion rate（ P <0.01），and up-regulated the expression levels of CRF and VIP in gastric mucosa（ P <0.01）.Compared with the model group，the acupuncture at Zusanli（ST 36） alleviated the plantar joint swelling（ P <0.05），cartilage damage，and inflammatory cell infiltration，increased the gastric emptying rate and intestinal propulsion rate（ P <0.05），accelerated intestinal peristalsis，and down-regulated the expression of CRF and VIP in gastric mucosa（ P <0.05）.In particular，hand acupuncture demonstrated better performance. Conclusion： Acupuncture at Zusanli（ST 36） can regulate intestinal motility disorder in CIA rats，and hand acupuncture has better therapeutic effect than electroacupuncture.843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F

Keywords Acupuncture; Hand acupuncture; Zusanli（ST 36）; Rheumatoid arthritis; Gastrointestinal motility; Visceral sensitivity; Corticotropin-releasing factor; Vasoactive intestinal peptide

中图分类号：R245 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2022.09.014

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是最普遍的慢性炎症性疾病之一，它主要累及关节，但该疾病应被认为是一种包括关节外表现的综合征[1]，在其发生发展的过程中，常累及体内多个脏器，从而表现出全身症状[2]，例如风湿性心脏病、血管炎、胃肠功能紊乱等，其中RA所导致的消化系统问题也得到越来越多学者的关注[3]。目前，导致RA并影响疾病严重程度和发病的机制尚不明确，因此，当前治疗RA策略主要是减轻症状而不是治疗病因。在疾病早期通常选用抗风湿类药物，非甾体抗炎药，糖皮质激素等来控制病情[4]，但这些药物需要长期服用，并会导致许多不良反应，而这些药物的不良反应最常发生在胃肠道，引起胃肠功能紊乱，导致呕吐、腹痛、胃出血等症状。

因此，胃肠功能紊乱已成为风湿病临床常见问题之一，如何改善RA局部疼痛和胃肠功能问题，并减少治疗中的不良反应，是目前研究的重点。针灸是中医特色疗法之一，作为补充与替代疗法，针灸在治疗各类疼痛以及提高患者生命质量等方面具有较大优势，特别是在治疗关节疼痛、调节胃肠功能以及各种慢性代谢性疾病方面[5]。研究表明，针灸对于RA的局部症状有明显的改善作用并提高患者的生命质量，但尚未说明其是否能改善由RA所引起的胃肠道问题[6]。因此，在前期研究针灸防治类风湿关节炎和胃肠疾病实验研究基础上[7-9]，我们采用单穴足三里，探讨针刺对RA关节的保护以及胃肠动力的调节作用，初步观察其作用机制，为针刺在RA胃肠动力障碍方面的临床应用提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1動物

选取12周龄无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）级雄性SD大鼠60只，动物喂养在湖北中医药大学实验动物中心完成，生产合格证号：SCXK（鄂）2020-0018号，环境温度21～25 ℃，湿度40% ～60%。光照时间每日12 h，大鼠可自由取食饮水。本实验严格遵守中华人民共和国科技部[2006]398号文件《关于善待实验动物的指导性意见》要求。

1.1.2主要试剂及仪器

Φ0.30 mm×13 mm华佗牌毫针（苏州医疗器械厂，货号：30255209574），电针治疗仪（上海华谊医用仪器有限公司，型号：G6805）;显微镜（ZWISS，德国，型号：Axiovert 40CFL），化学发光成像系统（Bio-Rad，美国，型号：ChemiDoc XRS+），电泳仪（Bio-Rad，美国，型号：164-5052），转膜仪（Bio-Rad，美国，型号：1704150）;牛Ⅱ型胶原（SIGMA公司，美国，货号：234184-M），弗氏不完全佐剂（SIGMA公司，美国，货号：F5506），CRF抗体（Abcam公司，英国，货号：ab184238），VIP抗体（Abcam公司，英国，货号：ab227603），β-actin抗体（Abcam公司，英国，货号：ab8227）。

1.2方法

1.2.1分组与模型制备适应性喂养1周后，随机数字表法分为4组，正常组、模型组、电针组，手针组，每组15只，其中每组选5只用于病理切片：苏木精-伊红（Hematoxylin Eosin，HE）染色，5只用于胃肠动力检测，另外5只用于蛋白免疫印迹法检测。参考文献[10]，将牛Ⅱ型胶原溶于0.5 mol/L醋酸，在4 ℃环境中溶化并过夜，制成终浓度为2 mg/mL溶液，再与等量弗氏不完全佐剂在冰浴下充分乳化制成乳剂，每只大鼠以0.1 mL乳剂的量，在足底部作皮内注射接种诱发免疫反应，7 d后将牛Ⅱ型胶原与等量弗氏不完全佐剂配制成剂，每只大鼠以0.1 mL的量注射于大鼠尾巴根部多点加强免疫，再次免疫14 d后造模完成。实验过程中可见各造模完成后的大鼠表现为前肢或对侧肢体甚至耳、尾部红肿或出现炎症结节，提示造模成功。

1.2.2干预方法于造模完成后采用针灸干预，参照中国针灸学会实验针灸研究会制定的“实验动物针灸穴位图谱”，选取双侧后三里，即大鼠的足三里穴，位于膝关节下外侧的腓骨小头下方约5 mm处。电针组：大鼠足三里穴位针刺深度约5 mm，连接电针治疗仪，选用频率2 Hz，强度为1 mA的连续波，持续时间15 min，1次/d，共治疗14 d。手针组：大鼠足三里穴位针刺深度约5 mm，行手法行针，平补平泻，频率约120次/min，强度以大鼠耐受为度，每隔4 min行针1 min，共留针15 min，1次/d，共治疗14 d。正常组和模型组均不处理。

1.2.3检测指标与方法

跖围法测量大鼠足跖肿胀度：以造模前为基线，分别测量干预时间段的3 d，7 d，14 d大鼠跖围，各组大鼠在同一时间用手术线环绕大鼠右下足跖部相应骨性标志处测量长度，每只大鼠每次分别测量3次取其平均值。

HE染色法观察膝关节病理形态：大鼠颈椎脱臼处死，将膝关节标本用4%多聚甲醛固定液固定，脱钙后，常规蜡块包埋，制作4 μm厚石蜡切片，经过脱蜡、染色、脱水、透明和封片的步骤后，在光学显微镜下观察软骨组织。

计算胃排空率检测胃动力：大鼠取材前24 h禁食不禁水，提前称取W1的黑色半固体糊状物（由羧甲基纤维素钠、奶粉、糖、淀粉、碳素墨水加蒸馏水配制成）进行灌胃，半固体糊浓度为1 g/mL，每只灌胃0.8 mL，30 min后，开腹取胃和小肠，分别记录胃总重W2和胃净重W3，胃排空率=[1-（W2-W3）/W1]×100%。843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F

计算肠推进率检测肠动力：同“计算胃排空率检测胃动力”处理取材，记录小肠全长L1及黑色半固体推进距离L2，计算公式如下，小肠推进率=L2/L1×100%。

肠蠕动波测定法检测大鼠肠蠕动波次数：以2%戊巴比妥钠（50 mg/kg体质量）尾静脉注射麻醉大鼠，体温维持37.5 ℃左右，将自制的结直肠扩张刺激球囊插入大鼠肛门内，记录单位时间（30 min）内的肠蠕动波个数。

蛋白质免疫印迹法测定胃黏膜组织中促肾上腺皮质激素释放因子（Corticotropin Releasing Factor，CRF）和血管活性肠肽（Vasoactive Intestinal Peptide，VIP）的表达水平：在冰上取胃组织后，提取蛋白并进行浓度测定，配制12% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行电泳、转膜、封闭、孵育一抗（4 ℃，过夜），孵育二抗后加入ECL发光液显影，使用化学发光成像系统进行扫描，运用Image J 软件分析目的蛋白条带CRF、VIP相对灰度值，其中肌动蛋白作为内参。

1.3统计学方法

采用GraphPad Prism 8.3.0软件进行统计分析和绘制图表，数据以均数±标准差（  ±s ）表示，符合正态分布且方差齐性组间比较采用单因素方差分析，不符合正态分布采用秩和检验，方差不齐性采用Dunnett′s T3检验，率的显著性比较采用χ2检验，以 P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1针刺对大鼠跖围的影响造模前，各组大鼠跖围测量结果比较差异无统计学意义（均 P >0.05），造模完成后3 d，模型组、手针组和电针组大鼠的跖围均发生肿胀，肿胀程度明显高于正常组，差异有统计学意义（均 P <0.05）;治疗后7 d，手针组和电针组的大鼠跖围减小，肿胀程度显著低于模型组（均 P <0.01），其中手针组的大鼠跖围改变更为明显;在治疗后14 d，手针组与电针组比较，差异有统计学意义（ P <0.05）。见图1。

2.2针刺对CIA大鼠模型的膝关节的影响正常组大鼠的关节面光滑，软骨细胞排列整齐，而模型组关节面有破损，软骨表层破损，细胞增生明显，周围有炎症细胞浸润，而手针组和电针组大鼠的膝关节面较模型组而言破损较少，破损程度轻，软骨细胞表面较光滑，并且手针组效果优于电针组。见图2。

2.3针刺对胃肠动力的影响模型制备过程中，大鼠出现食欲减退，体质量增加较正常组减少。与正常组比较，模型组大鼠胃排空率和肠推进率显著降低，且蠕动波次数减少（均 P <0.05）;治疗后，手针组和电针组大鼠胃排空和肠推进率有所提升，肠蠕动波显著增加、胃肠蠕动变快，与模型组比较差异有统计学意义（均 P <0.05），其中手针组大鼠胃肠动力改变最为明显，与电针组比较差异有统计学意义（ P <0.05）。见图3～5。

2.4针刺对胃黏膜组织中的CRF、VIP表达的影响与正常组比较，模型组大鼠的胃黏膜组织中的CRF、VIP表达水平显著升高，差异有统计学意义（均 P <0.01）;与模型组比较，手针组与电针组的大 鼠胃黏膜组织中的CRF、VIP水平显著降低，差异有

3讨论

RA是一种自身免疫性炎症性风湿性疾病，会影响多个组织和器官并引起慢性滑膜炎症，最终导致关节破坏，慢性残疾甚至是减短寿命[11]。中医的类风湿性关节炎属于“尪痹”“痹证”，中医认为其发病机制多与脾胃虚弱，阳气不足，卫外无力，风寒湿火等毒邪入侵，流于经络，机关不利有关[12]。足三里是治疗RA的常用穴位之一[13]。《针灸大成·治病要穴》中云：“足三里：主中风中湿，诸虚耳聋，上牙疼，痹风，水肿，心腹鼓胀，噎膈哮喘，寒湿脚气。上、中、下部疾，无所不治。”[14]足三里为多气多血之足阳明经合穴，有调理脾胃、通畅气机、通经活络之功效。本研究发现，针刺足三里后，CIA大鼠的跖围肿胀程度明显降低，并且其膝关节的HE染色结果也显示，其关节面的破损程度和炎症细胞浸润显著减轻，而手针的治疗效果要优于电针治疗，说明针刺足三里可以改善CIA大鼠的局部炎症症状，并减轻关节疼痛和肿胀，这与我们前期的实验研究结果一致[15]。同时，我们发现CIA大鼠存在明显的胃肠道问题，特别是对胃肠动力的影响，在模型组中胃排空率和肠推进率明显降低，肠蠕动波减少，说明其胃肠蠕动减慢，胃肠动力减弱。CRF是一种重要的神经内分泌肽，并且是介导应激反应的关键性调节因子[16]，参与抑制副交感神经和提高交感神经活动，在一定程度上可以反映内脏敏感性[17]。而VIP是一種肠肽激素，具有调节胃肠道的离子分泌、营养吸收和肠蠕动等作用[18]，本研究发现，模型组CRF、VIP的表达明显增多，进一步说明了CIA大鼠存在内脏敏感性提高和胃肠道功能障碍的问题。而在针刺足三里后，胃排空率和肠推进率显著提高以及肠蠕动波明显增多，并且胃黏膜组织中的CRF和VIP含量也显著降低，说明针刺足三里可调节CIA大鼠的胃肠动力，改善胃肠蠕动并且降低内脏敏感性。在之前RA的研究中，并未涉及到针灸对于其胃肠动力的调节作用，而我们选用针刺治疗RA不仅反映其对局部关节炎具有调节作用，同时也为RA所发生的胃肠动力问题提供了新的治疗思路。

RA与胃肠道关系紧密，并提出肠-关节轴的理论假说[19-20]，认为胃肠道疾病与RA的发病是相互影响的关系。有研究发现在RA患者的肠道微生物群中检测其多样性降低、微生物失调，但在RA治疗后可部分缓解[21]。同时有学者发现肠道营养不良会触发黏膜免疫反应，从而刺激T和B细胞，进一步促进炎症性关节炎的发展[22]。并且RA中许多与免疫相关的异常都发生在黏膜水平，在RA的发展过程中，肠黏膜免疫反应被放大，抗原呈递细胞被异常激活，免疫耐受受到干扰[23]，从而引起胃肠道反应。据临床报道，RA患者不仅出现吞咽困难，烧心、反酸的食管反流临床表现，而且可因小肠蠕动减慢，出现饱腹感，恶心、呕吐、胃痉挛、餐后腹痛或腹胀等内脏敏感性增强[24]。足三里位于膝关节局部，针刺足三里可以调节局部关节炎症反应[25]。并且足三里作为调理脾胃的要穴，也常用于治疗胃肠系统疾病，并在动物实验和临床试验中均证实其有改善胃肠动力和调节内脏敏感性的作用[26-27]。基于此，我们研究了针刺足三里是否能够改善RA的局部关节症状以及其导致的胃肠动力问题。843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F

综上可见，针刺足三里不仅缓解了CIA大鼠的关节疼痛及肿胀症状，同时也改善了CIA大鼠引起的胃肠动力问题，对机体整体具有较好的调节作用。而这一实验思路，也为临床治疗RA提供了新的途径。但是RA和胃肠动力如何进行联系仍不明确，其治疗的具体机制也有待进一步研究。

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（2021-04-09收稿本文编辑：杨觉雄）

基金项目：国家自然科学基金项目（81774410）——基于软骨细胞骨架蛋白探讨温针灸对骨关节炎的调节作用;湖北省卫健委项目（ZY2021M018）——温针灸对骨关节炎大鼠微循环的调控作用作者简介：谈倩（1995.08—），女，硕士研究生在讀，研究方向：针灸治疗骨关节病，E-mail：1298093978@qq.com通信作者：蔡国伟（1964.12—），男，硕士，主任医师，副教授，研究方向：针灸治疗骨关节病，E-mail：cgw645@163.com843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F