QuEChERS dSPE EMR-Lipid-UPLC-MS/MS测定蜂蜜中4种硝基咪唑药物残留

王华 刘虹虹 罗达龙

摘 要：目的：建立以QuEChERS dSPE EMR-Lipid-UPLC-MS/MS的方法对蜂蜜中的塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑和奥硝唑进行测定。方法：用Na2EDTA-磷酸盐缓冲液对蜂蜜中的待测组分进行提取，用QuEChERS dSPE EMR-Lipid进行净化，采用液质联用仪进行测定，并利用SOULAB-ST C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，

1.8 µm）对物质进行分离，用质谱多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）进行采集。结果：4个化合物在0.2～25.0 μg/kg线性良好，检出限均为0.06 μg/kg，定量限均为0.2 μg/kg，在0.2 μg/kg、1.0 μg/kg和10.0 μg/kg 3个添加水平的回收率为86.2%～97.0%，相对标准偏差为2.4%～6.5%。结论：该方法具有操作简易快速、定性定量准确、灵敏度高等特点，能应用于日常样品的检验检测。

关键词：蜂蜜;硝基咪唑;药物残留

Determination of Four Nitroimidazole Residues in Honey by UPLC-MS/MS with QuEChERS dSPE EMR-Lipid

WANG Hua， LIU Honghong*， LUO Dalong

（Wuzhou Institute for Food and Drug Control， Wuzhou 543000， China）

Abstract： Objective： A QuEChERS dSPE EMR-Lipid-UPLC-MS/MS method was established for the determination of secnidazole， metronidazole， tinidazole and ornidazole in honey. Method： The components to be tested in honey were extracted with Na2EDTA-phosphate buffer， purified by QuEChERS dSPE EMR-Lipid， and detected by UPLC-MS/MS with the SOULAB-ST C18 chromatographic column（100 mm×2.1 mm， 1.8 µm） under multiple reaction monitoring（MRM） mode. Result： There was a good linear relationship between the four kinds of nitroimidazole residues in the range of 0.2～25.0 μg/kg. The limits of detection was 0.06 μg/kg and the limits of quantitation was 0.2 μg/kg. The recoveries at three spiked levels of 0.2 μg/kg， 1.0 μg/kg and 10.0 μg/kg ranged from 86.2% to 97.0% with relative standard deviation of 2.4%～6.5%. Conclusion： The method had the advantages of simple operation， qualitative and quantitative accuracy， high sensitivity. It could be applied to daily inspection.

Keywords： honey; nitroimidazole; drug residue

蜂蜜中富含糖類、维生素、氨基酸和多种矿物质等，蜂蜜具有护肝、润肺、增强人体免疫的功能[1]。蜂蜜不仅作为一种营养食品，因其具有一定的药理作用，也被称作医家良药，在临床上用于消化系统、创伤治疗等疾病的治疗[2-3]。因此蜂蜜也成了消费者追捧的产品，在蜂业养殖中为避免蜂群受到疾病感染，会出现抗生素滥用的情况。塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑、奥硝唑为《中国药典》2020年版收录的4个具有5-硝基咪唑基本结构的药物，该药物具有抗原虫、抗厌氧菌的作用。在养殖蜜蜂时，养蜂人为避免蜂群出现疾病感染，会使用此类抗生素。由于硝基咪唑类药物具细胞诱变性，有潜在致畸、致癌和致突变的作用，甚至有遗传毒性[5-8]。该类药物在蜂蜜样品中的残留会对食品安全构成直接威胁，且上述4种药物，在药房易于购买获得，因此需加强检测。

蜂蜜在食品工业与药用辅料中有着不可或缺的地位，为保障食品与药用安全，有必要建立一种前处理简单、检测快速、检测限低、定性与定量准确的测试方法。目前，硝基咪唑类药物的相关检测方法为试剂盒快速检测方法、液相色谱法和气相色谱质谱等方法[4]。蜂蜜中存在约70%～80%的糖，糖的去除是实验中的难点。如在前处理中不对糖进行去除，糖会随着流动相带入色谱系统与质谱系统，在色谱系统中会导致进样针与色谱柱的堵塞，也会影响质谱电喷雾过程，使测定的目标物受到基质干扰，产生基质增强或抑制效应，进而导致检测结果不准确。本方法使用了Na2EDTA-磷酸盐缓冲液作为提取溶剂，以QuEChERS dSPE EMR-Lipid为净化剂，SOULAB-ST C18色谱柱为分离手段，运用UPLC-MS/MS中的多反应监测模式对蜂蜜样品中的塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑和奥硝唑进行检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

色谱纯乙腈、甲醇购自于欧姆尼公司;分析纯试剂无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸二钠盐购自于上海麦克林生化科技有限公司;净化剂QuEChERS dSPE EMR-Lipid购买于安捷伦科技有限公司。实验用水为密理博纯水机制备的去离子水;塞克硝唑、甲硝唑、奥硝唑和替硝唑购自中国食品药品检定研究院，含量均不小于99.0%。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱仪Agilent LC1290，液质联用仪Agilent-QQQ-6470（Agilent Technologies），超纯水仪（Millipore）;涡旋振荡仪（Thermo Fisher Scientific）;超声波清洗仪（ELMA）;冷冻离心机（SIGMA）。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液的配制

（1）提取溶剂的配制。取65 mL浓度为0.2 mol/L的磷酸二氢钠溶液与435 mL浓度为0.2 mol/L的磷酸氢二钠溶液进行混合后，向混合溶液中加入18.6 g乙二胺四乙酸二钠盐试剂，经超声波清洗仪超声溶解后混匀即得Na2EDTA-磷酸盐缓冲溶液。

（2）标准储备液的配制。精密称取标准物质塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑、奥硝唑25 mg至4个25 mL容量瓶中，用色谱级甲醇试剂将标准物质溶解，配制得到1 mg/mL的储备液，避光保存于2～8 ℃冰箱。

（3）混合标准液的配制。分别吸取塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑及奥硝唑储备液各25 μL到同一个

25 mL容量瓶，用色谱纯甲醇试剂进行稀释得到质量浓度为1.0 μg/mL的混合标准液，存放于2～8 ℃冰箱避光保存。

（4）基质标准工作溶液的配制。吸取混合标准液，用阴性样品经前处理后所得到的溶液对混合标准液进行稀释，配制得到的基质标准工作溶液S1～S5浓度分别为0.04 ng/mL、0.2 ng/mL、1.0 ng/mL、

2.0 ng/mL和5.0 ng/mL，现配现用。

1.3.2 前处理方法

（1）样品制备。若蜂蜜样品中不含有结晶，将其搅拌均匀，备用。如蜂蜜样品中含有结晶，在保证其包装为密封状态下，将样品放置于60 ℃以下的水浴中加热、振荡，等蜂蜜样品全部融化后再把样品搅拌均匀，冷却至室温，即可使用。

（2）样品的提取。称取蜂蜜样品5.00 g到100 mL离心管中，精密加入提取溶剂10 mL，涡旋混合2 min，备用。

（3）样品的净化。吸取提取液5.00 mL至EMR-Lipid净化管中涡旋混合2 min，精密加入色谱级乙腈试剂5 mL，涡旋混合5 min，在4 ℃下以8 000 r/min离心5 min，吸取上清液0.50 mL到2 mL离心管中，向离心管加入0.50 mL超纯水混合均匀，溶液用0.2 μm有机滤膜过滤，待测定。

1.3.3 测试条件

（1）色谱参数。自动进样器进样量：3 μL;柱温箱恒温温度：35.0 ℃;色谱柱规格：SOULAB-ST C18（100 mm×2.1 mm，1.8 µm）;流动相组成：甲醇与0.2%甲酸水溶液;流动相流速：0.35 mL/min;液相色谱流动相梯度：0～0.5 min，10%的甲醇保持

0.5 min;0.5～3.5 min，甲醇由10%变化至90%;3.5～4.5 min，90%的甲醇保持1 min;以10%的甲醇比例后运行1.5 min。

（2）质谱参数。正离子模式下喷射流离子源（AJS ESI+），干燥氮气温度（150 ℃）;干燥氮气流速

（10 L/min）;鞘气温度（325 ℃）;鞘气流速（10 L/min）;正模式喷嘴电压（+500 V）;正模式毛细管电压（+4 000 V）;雾化器压力（30 Psi）。质谱参数见表1。

2 结果与分析

2.1 实验条件优化

2.1.1 提取及净化方法的选择

蜂蜜中的主要成分是糖分，约占蜂蜜的70%～80%，前处理中需使用净化方法去除糖。如去除糖不完全，会导致色谱柱寿命下降，离子源喷雾针中积累碳化物，同时也会影响待测组分的离子化效率，影响检测方法的灵敏度。硝基咪唑类化合物在弱碱条件下以游离分子的形式存在，故本实验采用偏碱性的Na2EDTA-磷酸缓冲溶液对蜂蜜样品进行提取，使样品得到更好的分散性以提高目标物的提取效率，提取溶剂中含有Na2EDTA、磷酸盐，Na2EDTA在提取液中可与样品中含有的金属离子进行螯合，减少金属离子催化导致待测组分的降解。糖溶解于磷酸盐水溶液中，样品经EMR-Lipid净化后使用乙腈把待測组分萃取到乙腈层，使目标物与糖分别在不同的溶剂层，以达到净化效果。

2.1.2 稀释溶剂优化

液相色谱在分离过程中会存在一定的溶剂效应，如上机溶液选择不合适，会影响物质的保留与色谱峰的峰形，进而影响物质在质谱的响应强度。基于此，本研究用阴性样品经前处理后得到的乙腈层溶液进行稀释，制成含80%乙腈、50%乙腈的水溶液。分别使用乙腈、80%乙腈的水溶液、50%乙腈的水溶液将混合标准溶液配制成待测组分的浓度为5 ng/mL的标准液，上机测试，记录色谱峰的拖尾因子。在使用乙腈、80%乙腈配制的标准液中，甲硝唑与替硝唑色谱峰产生前沿峰，拖尾因子为0.90～0.93;而使用50%乙腈水溶液配制的标准液中，所得物质的色谱峰峰形对称且尖锐，拖尾因子为1.01～1.03，符合拖尾因子0.95～1.05的要求。待测组分溶于乙腈体系中与流动相极性相差较大，产生溶剂效应，进而使待测组分的峰形受到影响。对此为消除溶剂效应，本方法中使用含50%乙腈的空白基质提取液作为标准溶液的稀释液。

2.1.3 色谱条件优化

（1）色谱柱选择。色谱柱在实验中对于样品的分离非常重要，为确保待测组分在色谱柱上有较好的保留与分离效果，比较了柱1 SOULAB-SH C18（150 mm×4.6 mm，3 µm）、柱2 SOULAB-AM C18（150 mm×3.0 mm，3 µm）、柱3 SOULAB-ST C18（100 mm×2.1 mm，1.8 µm）3种色谱柱对4个待测组分的分离效果。使用柱1与柱2这两款色谱柱所需的流动相流量较大，与质谱电喷雾离子化方式不匹配，物质离子化效率较低，所得的质谱响应强度较低。相对于柱1、柱2，使用柱3能使化合物具有更好的分离效果及峰形，小粒径色谱柱具有高柱效且能节省溶剂，适用于UPLC仪器。综合考虑物质保留时间、色谱峰峰形与检测灵敏度，选择柱3作为本实验分析柱。

（2）流动相选择。本文分别比较了使用有机溶剂甲醇、乙腈作为流动相时对所测定的4种化合物分离效果的影响。结果显示，当使用甲醇作为流动相时，化合物在色谱柱上的保留与分离效果优于乙腈。考虑到待测组分需要与杂质进一步分离，故选择甲醇作为该实验中的有机相。由于4个化合物均采用正模式下的电喷雾离子化，在水中加入一定浓度的酸可以促进化合物的电离。故本研究通过比较在水溶液中加入0.1%～0.5%的甲酸，考察对4个化合物的影响。结果显示，随着流动相中甲酸浓度的增大，4种化合物在质谱测定中得到的峰面积略有增大，但基线噪声也明显提高。综合不同浓度的甲酸作为流动相下所测得物质的信噪比与色谱柱pH的耐受性考虑，选择0.2%甲酸作为水相，化合物的色谱图见图1。

2.2 检出限、定量限与线性关系考察

取S1～S5基质标准工作溶液，按测试条件进行测定，通过仪器测试得到各化合物定量离子的峰面积。以配制的基质标准工作溶液浓度（x）为横坐标，化合物峰面积（y）为纵坐标，得出回归方程;通过在空白样品中加入标准溶液后对样品进行提取、净化来进行确认本方法所能达到的检出限与定量限，使用工作站对信噪比进行计算，当目标峰峰高与基线噪声的比值≥10，即为定量限;当目标峰峰高与基线噪声的比值≥3，即得出检出限。结果表明，4个化合物检出量在0.2～25.0 μg/kg线性良好，相关系数均大于0.995，检出限均为0.06 μg/kg，定量限均为0.2 μg/kg。化合物回归方程与相关系数见表2。

2.3 回收率实验

取空白基质样品进行加标，通过调节标准溶液的加入体积，使添加量达到0.2 μg/kg、1.0 μg/kg、10.0 μg/kg，每个加标级别进行6份平行加标实验，并同步进行空白测试，使用基质标准工作曲线对4个待测组分进行定量分析，结果见表3。4个化合物的加标回收率为86.2%～97.0%，相对标准偏差为2.4%～6.5%，均小于10%，表明本方法具有较好的回收率与重现性，可满足蜂蜜中的塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑和奥硝唑的测定。

2.4 样品的测定

通过购买市场上销售的蜂蜜样品共20批次，按建立的方法进行前处理并测试，结果20批样品中均未检出塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑和奥硝唑。

3 结论

本研究建立了QuEChERS dSPE EMR-Lipid-UPLC-MS/MS方法测定蜂蜜中塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑和奥硝唑，EMR-Lipid凈化剂能有效去除蜂蜜样品中的糖类，用SOULAB-ST C18色谱柱对塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑和奥硝唑进行色谱分离，通过质谱联用仪的MRM模式进行检测。方法中使用了空白基质提取液配制标准曲线，相比使用内标物的方法，节省了购买内标物的费用，部分物质的内标物也不容易获得。该方法具有操作简单、快速、定性与定量准确、灵敏度高等特点。本方法使用的净化剂对糖、脂质具有高选择性，能有效去除样品基质中的糖分。糖分的去除能提高待测组分在质谱仪上的离子化效率，减少分析过程中的基质干扰，以提高测试结果的稳定性与可靠性，减少了色谱与质谱的维护成本。

参考文献

[1]冯强，何晋浙，孙培龙.我国蜂产品质量安全问题分析[J].中国蜂业，2011，62（6）：28-31.

[2]张璐，孔祥虹，王菡，等.在线净化-超高效液相色谱同位素稀释串联质谱法检测蜂蜜中硝基咪唑类及其代谢物的残留[J].分析化学，2014，42（12）：1735-1742.

[3]吴国泰，武玉鹏，牛亭惠，等.蜂蜜的化学、药理及应用研究概况[J].蜜蜂杂志，2017，37（1）：3-6.

[4]汪建妹，杨华，曾银欢，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中抗生素和农药浓度[J].浙江大学学报（理学版），2018，45（3）：330-342.

[5]唐志理，侯思羽，邢东海，等.PRiME HLB-超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中硝基咪唑类药物残留量[J].食品安全质量检测学报，2020，11（18）：6716-6723.

[6]刘青，张巍，张振华，等.陕西省蜂蜜中甲硝唑和氯霉素膳食暴露风险评估[J].中国卫生检验杂志，2021，31（21）：2592-2594.

[7]张海超，贾海涛，张婧雯，等.固相萃取/液相色谱-串联质谱法测定兽药制剂中非法添加8种硝基咪唑类药物[J].现代畜牧兽医，2021（10）：20-24.

[8]何连军，王鼎南，张宜明，等.通过型固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中的5种硝基咪唑和地西泮[J].核农学报，2021，35（8）：1865-1874.