磁微粒化学发光法在食品中百草枯残留量检测的应用研究

唐洁 莫绪 张启韩

摘 要：百草枯（Paraquat，PQ）又称巴拉利，是一种有效的除草剂，具有触杀作用和一定内吸作用，能迅速被植物绿色组织吸收，制其枯死。百草枯在植物中容易产生残留，对人体毒性极高，且无特效解毒药，是人类急性中毒死亡率最高的除草剂，但因其高效、实用性，仍然未能完全杜绝其应用，每年百草枯中毒现象仍时有发生。因此，建立快速、准确、灵敏的食品中百草枯残留检测对有效监测食品安全、控制农药滥用具有非常重要的意义。本文利用磁微粒化学发光免疫检测方法对百草枯6个不同浓度的标准液C1～C6进行了定量分析。结果表明，该方法准确性、灵敏度、特异性、精密度以及稳定性分析均优于国家标准要求。

关键词：百草枯;磁微粒化学发光法;定量检测

Application of Magnetic Particle Luminescence Technology in the Determination of Paraquat Residues in Food

Tang Jie， Mo Xu， Zhang Qihan

（Guilin Normal College， Guilin 541199， China）

Abstract： Paraquat （PQ）， also known as Balali， is an effective herbicides. It has contact killing effect and certain internal absorption effect， which can be quickly absorbed by plant green tissue to make it wither. Paraquat is easy to produce residues in plants， highly toxic to human body， and there is no specific antidote. It is the herbicide with the highest mortality of acute poisoning in human beings. However， due to its high efficiency and practicality， the application of paraquat is still not completely eliminated， and paraquat poisoning still occurs from time to time every year. Therefore， the establishment of rapid， accurate and sensitive detection of paraquat residues in food is of great significance to effectively monitor food safety and control pesticide abuse. In this paper， 6 different concentrations of paraquat standard solutions C1～C6 were quantitatively analyzed by magnetic particle chemiluminescence immunoassay. The results show that the accuracy， sensitivity， specificity， precision and stability of the method are better than the requirements of the national standard.

Keywords： paraquat; magnetism particulate immune-chemistry luminescence method; quantitative detection

截止到2020年，包括中国、英国、欧盟、丹麦、俄罗斯及巴西等20多个国家已经禁止或者严格限制使用百草枯。目前国内外应用于禁用农药残留的检测技术为气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-串联质谱法、液相色谱-串联质谱法和免疫分析法等[1]。

色谱分析法由于检测仪器体积庞大，对使用环境及操作者素质都有非常高的要求，同时检测时间过长，只适合在特定的实验室由专业人员进行操作，难以普及推广应用;免疫分析法主要根据体外生成原理，利用抗体作为生化探测器实现对农残的定性和定量分析;其中，采用酶联免疫吸附（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、熒光免疫分析（Fluorescence Immunoassay，FIA）进行检测都查到有相关文献报道。但食品中农药残留的量往往非常低，这些方法由于其检测灵敏度和精密度偏低，因而检测结果达不到国家标准要求的检出率。在免疫分析法中，利用磁微粒化学发光法技术检测百草枯农药残留还未见报道[2]。

本文采用单克隆抗体、AP酶标记以及磁微粒分离技术，建立了百草枯的磁微粒化学发光免疫定量检测方法。该方法是在免疫分析法基础上发展起来的集化学发光、特异性免疫分析及磁微粒分离等技术于一体的新型检测技术，相对于其他传统分析方法，该技术具有灵敏度高、检测范围宽、检测结果准确、检测成本低及易于实现自动化操作等系统性优势，最低可检测到10-18 g量级，能及时有效地为监管机构提供监测数据，为政府职能部门监测和控制农药滥用提供现实依据[3-5]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三羟甲基氨基甲烷（Tris），西陇化工股份有限公司;氯化钠，西陇化工股份有限公司;牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA），Sigma有限公司;甘露醇，西陇化工股份有限公司;海藻糖，西陇化工股份有限公司;BRONIDOX-L，天津希恩思生化科技有限公司;吐温20（Tween20），上海联迈生物工程有限公司。试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

电子天平：AR224CN（奥豪斯仪器有限公司）;冷冻离心机：SF-TGL-20R（上海菲恰尔）;pH计：Sartoriuspp-20;蛋白测定仪：K9840（山东还能科学仪器有限公司）;集热试恒温加热搅拌器：DF-101S（郑州长城科工贸有限公司）;细胞破碎仪：SM-650A（南京舜玛仪器设备有限公司）;制冰机：ZBL-35（上海安亭科学仪器厂）。

1.3 实验方法

1.3.1 试剂缓冲液配制

依次称取以上物质溶解到800 mL纯化水里，用盐酸调节pH值为7.4，并定容为1 000 mL的储备液备用，分别为Tris（0.01 mol/L）、氯化钠（0.15 mol/L）、BSA（0.5 mol/L）、甘露醇（0.5 mol/L）、海藻糖（0.5 mol/L）、BRONIDOX-L（0.01 mol/L）及Tween20（0.05%）。

1.3.2 检测试剂盒主要组份的制备

检测试剂盒主要组份由试剂R1、试剂R2及标准液组成。

（1）PQ试剂R1配制。生产工艺流程如图1所示，采用抗体偶联操作工艺。①取10.00 mL磁珠微球（固体物10%），磁分离10 min，弃上清，用100 mL 0.5 mol/L、pH 5.0的MES缓冲液重悬，在混匀仪上混匀10 min;磁分离10 min，弃上清，加入100 mL 0.5 mol/L、PH 5.0的MES缓冲液重悬。②称取100 mg N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS），用0.5 mol/L、pH为5.0的MES缓冲液充分溶解至10.0 mg/mL;称取50 mg EDC，用0.5 mol/L、pH为5.0的MES缓冲液充分溶解至10.0 mg/mL。③在搅拌的条件下，往磁珠微球中先后加入10 mL NHS溶液和5 mL EDC溶液，混匀;④在搅拌的条件下，往磁珠微球中加入百草枯抗体10.00 mg，混匀;⑤磁分离10 min，弃上清，用100 mL 0.5 mol/L、pH为5.0的MES缓冲液重悬，混匀;⑥磁分离10 min，弃上清，加100.0 mL 10%BSA重悬，混匀;⑦磁分离10 min，弃上清;用100 mL 0.5 mol/L、pH为5.0的MES缓冲液重悬，混匀即得。

（2）PQ试剂R2配制。R2生产工艺流程如图2所示，采用抗原标记操作工艺。①称取5 mg百草枯化合物，12 mg DSS，用200 µL DMSO溶解，再加入10 µL N-甲基吗啉，混合均匀，37 ℃反应90 min。②反应完成之后再加入1 mL的DMSO，得到百草枯活化液待用。③取1 mg AP酶溶解在0.1 mol/L Tris，pH为8.0的缓冲液中，加入600 µL百草枯活化液，反应30 min。④反应完成之后，加入100 µL 1 mol/L甘氨酸，反应15 min。⑤用蛋白测定仪确定蛋白标记物浓度。⑥用酶标记物稀释液稀释至25 μg/mL。

1.3.3 標准液的制备

将百草枯国家标准物（货号：YJ-XXXX）用0.1 mol/L PH为7.4的PBS缓冲液溶解成1 mg/mL母液;再分别稀释成0 ng/mL、5 ng/mL、25 ng/mL、125 ng/mL、250 ng/mL及500 ng/mL 6个不同浓度的标准液C1～C6。

2 结果与分析

用6个不同浓度标准液对发光仪进行定标后，分别进行准确性、灵敏度、特异性、精密度以及稳定性分析。

2.1 准确度分析

将1 mL高浓度标准液C5（250 ng/mL）加入到9 mL低浓度标准液C1（0 ng/mL）中，混匀后在化学发光免疫分析仪上测试混合液和低浓度标准液浓度值，各测试3次，计算平均值，回收率应在85%～115%。根据公式（1）计算结果，回收率为99.58%，在要求范围以内。测试数据见表1。

（1）

式中：R为回收率，%;V为加入高浓度标准液体积，mL;V0为低浓度标准液的体积，mL;C为混合液测试平均值，ng/mL;C0为低浓度标准液测试值，ng/mL;Cs为已知高浓度标准液浓度，ng/mL。

2.2 灵敏度评估

取标准液C1和C2作为待测样本，在化学发光测定仪上对C1进行20次测定，C2测试3次，统计测量结果的发光值（RLU），计算C1的平均值（M）和标准差（Standard Deviation，SD），得出M-2SD;同时根据C1和C2之间的发光值（RLU）进行两点回归拟合得出一次方程，将M-2SD的RLU值代入上述方程中，求出对应的浓度值，即为产品的灵敏度，要求灵敏度不能大于5 ng/mL（国家标准要求最低残留量）。从表2数据可以计算得出，试剂检测灵敏度为0.37 ng/mL，远远小于5 ng/mL，产品具有很高的灵敏度。

2.3 特异性分析

往试剂盒中滴加干扰物并在化学发光测定仪上分别测定浓度为500 ng/mL的干扰物多菌灵和毒死蜱，各测试3次，测定结果应不得高于0.5 ng/mL。从表3数据可以看出，两组干扰物的测试结果均远远小于0.5 ng/mL，说明试剂盒受干扰物影响很小，具有很高的特异性。

2.4 精密度

在化学发光测定仪上分别测定标准液C2和C5，各重复测试至少10次，分别计算测量值的平均值（x）和标准差（SD）[6]。计算变异系数（Coefficient of Variation，CV），结果应≤8%。由表4可知，标准液C2和C5变异系数均小于8%，产品的精密度很高。

2.5 稳定性评估

将制备好的试剂盒进行37 ℃加速老化7 d后，用化学发光免疫分析仪测试，对测试结果的发光值（RLU）进行对照，数据见表。从表5中统计结果可以看出，实验组的蛋白活性回收率达到了95%以上，说明试剂盒稳定性很好。

3 结论

利用磁微粒化学发光法技术对百草枯6个不同浓度的标准液C1～C6进行检测，通过准确性、灵敏度、特异性、精密度以及稳定性分析，可以得到回收率为99.58%，检测灵敏度为0.37 ng/mL，精密度≤8%，蛋白活性回收率可达到98.17%。

参考文献

[1]邢晶晶.生物样本百草枯检测方法的建立及临床应用[D].南京：南京医科大学，2017.

[2]于超，杨少明，王术，等.不同方法检测新型冠状病毒血清抗体与凝血功能的结果探讨[J].血栓与止血学，2020，26（6）：903-906.

[3]郭兰英，万东山，张怡青，等.磁微粒化学发光法测定牛乳中呋喃它酮代谢物抗生素残留方法的建立[J].中国卫生检验杂志，2014，24（19）：2778-2780.

[4]吴军燕，成芳菲.磁微粒化学发光法检测肺炎支原体IgM抗体的临床应用[J].中外医学研究，2021，19（30）：77-79.

[5]张立娟.磁微粒化学发光法与酶联免疫吸附法测定抗中性粒细胞胞浆抗体的结果比较[J].中国免疫学杂志，2016，32（8）：1175-1178.

[6]梁高道，毛翔，黄常刚，等.全自动磁微粒化学发光法快速筛查呋喃类药物残留[J].环境科学与技术，2019，42（1）：178-183.