添加剂对黑麦草青贮品质及微生物数量的影响

付志慧, 格根图*, 贾玉山, 王志军, 孙 林, 南丁罕, 岳正山, 闫 峰，任秀珍

(1.内蒙古农业大学草原与资源环境学院，农业农村部饲草栽培、加工及高效利用重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010019；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特010031； 3.内蒙古正奇农牧业有限公司，内蒙古 呼和浩特 010031；4.内蒙古民族大学农学院，内蒙古自治区饲用作用工程技术研究中心，内蒙古 通辽 028000)

黑麦草(Loliumspp.)是一种生长速度快、产量高、品质优、适口性好的优质牧草，深受各种家畜喜爱[1]，常做青贮饲料的原料，是欧洲奶牛养殖的首选饲草品种。在我国，属南方地区的优势草种，多用做作物倒茬、草田轮作、种草养畜等，但由于其在北方地区不能安全越冬的生长特性，在北方地区尚未推广开来，但实现牧用黑麦草规模化集约化生产，对于我国各地区“就地就近保障饲草料供应，实现农牧循环发展”，具有重要意义。

由于黑麦草刈割时其鲜草含水量高达80%以上，若不经处理直接青贮容易导致丁酸发酵[2]。一般情况下将原料直接青贮，植物表面附生的有害微生物会在发酵进程中水解蛋白质，造成干物质大量损失，从而影响青贮发酵品质[3]。因此，在加工调制时选择恰当的添加剂来促进青贮发酵过程或提高青贮饲料的有氧稳定性已成为一种常规青贮手段。田允波[4]、杨雪霞[5]、Rauramaa A等[6]研究表明调制青贮饲料时添加乳酸菌外源添加剂、纤维素酶制剂等，均会改善青贮饲料的发酵品质，促进乳酸发酵进程、提高青贮饲料的消化率。

青贮饲料是一个复杂的微生物共生体系[7]，牟林林等[8]研究表明青贮发酵进程是诸多微生物共同作用的结果，这些微生物主要分为两大类，即对发酵起着积极作用的有益微生物和降低发酵品质的有害微生物。有益微生物包含植物乳杆菌等微生物，主要产生乳酸迅速降低pH值，同时包含抑制梭菌发酵的同型发酵乳酸菌和发酵糖等，还包括产生乳酸、乙酸和乙醇等的异型发酵乳酸菌，均能使青贮料保持良好的有氧稳定性，延长保存时间；有害微生物包括一般好氧性细菌、霉菌和梭菌等[8]。一般好氧性细菌常分解蛋白质和氨基酸从而产生NH3；霉菌较易分解糖和乳酸，会导致青贮料发生有氧腐败；梭菌一般在厌氧状态下生长会分解利用糖、有机酸和蛋白质，从而产生丁酸及氨等物质，也是导致青贮腐败的常见原因之一[9-10]。因此，研究青贮前后微生物数量的变化十分重要。目前，针对黑麦草青贮及添加剂对黑麦草青贮品质的影响研究颇多，但结合添加剂对青贮品质及青贮前后微生物数量变化的研究鲜见报道。本研究旨在探讨不同添加剂对北方地区黑麦草青贮前后微生物数量的变化及发酵品质的影响，为黑麦草在北方地区规模化生产中选择优质添加剂提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料是品种为‘特高’的多花黑麦草，于2019年5月26日种植于内蒙古农业大学牧草试验基地，同年9月2日(孕穗期)第4茬刈割，萎蔫至含水量65%左右，作为青贮原料，原料成分见表1。所用添加剂为A1(植物乳杆菌：由日本国际农林水产研究中心蔡义民研究员惠赠)、A2(复合菌剂：乳酸菌+纤维素酶，购自日本雪印会社)、A3(商业菌剂：和美科盛乳酸菌标准品+糖蜜，由内蒙古正奇农牧业有限公司提供)。

表1 多花黑麦草原料化学成分及微生物数量Table 1 Chemical composition and microbial quantity of Italian ryegrass before ensiling

1.2 试验方法

1.2.1试验设计 试验采用单因素随机区组设计，设置4个处理，分别为对照(CK)、A1(植物乳杆菌、2.5 g·t-1)、A2(复合菌剂、17 g·t-1)、A3(商用菌剂、1 000 g·t-1)，添加量以鲜重计算，使用时活菌数106cfu·g-1，每个处理3次重复。将收获的黑麦草萎蔫至含水量65%左右，切短至3～5 cm，搅拌均匀，装入聚乙烯青贮袋，每袋300 g左右，采用真空封口机抽气密封，放于室内常温条件下避光保存，青贮60 d后开袋，将样品混匀后进行青贮饲料感官评价、营养品质、发酵品质及微生物数量分析。

1.2.2样品处理 青贮60 d后开袋取样，将样品搅拌混合均匀，称取10 g样品与90 mL无菌水混合均匀，放入拍打袋中用均质拍打器(品牌为净信，上海净信实业发展有限公司购买)拍打120 s，制备浸提液，用定性滤纸过滤后置于离心管中于-35℃冰箱保存待测发酵品质。另取10 g样品置于三角瓶中，加入90 mL无菌水、无菌生理盐水(0.85%NaCl)，用封口膜封口，用于测定微生物数量。将剩余青贮样品收集置大号信封纸袋中，105℃烘箱中杀青30 min后再将温度调至65℃烘干48 h至恒重，用于待测营养品质。

1.3 测定指标及方法

1.3.1感官品质评价 根据德国农业协会(DLG)感官青贮评定方法及等级标准[8]从气味、结构、色泽3方面进行评价，满分为20分，20～16分为优良，15～10分为尚好，9～5分为中等，4～0分为腐败，评定标准见表2。

表2 青贮饲料感官品质评定标准Table 2 Sensory quality evaluation standards of silage

1.3.2营养品质测定 采用烘干法[11]进行干物质(Dry matter，DM)含量的测定；使用FOSSKJ2300型全自动定氮仪进行粗蛋白质(Crude protein，CP)含量测定[11]；采用GB6439-92燃烧法进行有机物(Organic matter，OM)含量测定[11]；采用ANKOMA2000i全自动纤维仪进行中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber，NDF)含量测定[12]；采用蒽酮-硫酸比色法进行可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrates，WSC)含量测定[13]。

1.3.3发酵品质测定 用pH计测定取样品处理时制备的浸提液的pH值[14]；使用高效液相色谱仪(HPLC)测定乳酸(Lactic acid，LA)、乙酸(Acetic acid，AA)、丙酸(Propionic acid，PA)和丁酸(Butyric acid，BA)含量，并计算乳酸/乙酸(LA/AA)及总酸(Total acid，TA)的含量，从而分析滤液中的有机酸的含量[15]；氨态氮(NH3-N)含量用苯酚-次氯酸钠比色法测定[15]。以氨态氮和挥发性脂肪酸(Volatile fatty acid，VFA)为评价指标，选用日本草地畜产协会(2001)制定的青贮饲料发酵品质V-Score评分标准[16]。

1.3.4微生物数量测定 用样品处理时制备的待测微生物数量的菌液，稀释10-1，10-3，10-5，采用平板计数法计算微生物数量[17]。乳酸菌采用乳酸菌固体(De Man，Rogosa and Sharpe，MRS)培养基，霉菌和酵母菌采用马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar，PDA)培养基，大肠杆菌采用大肠菌群液体显色(Blue Light Broth Agar，BLB)培养基，一般好氧性细菌采用营养琼脂(Nutrient Agar，NA)培养基，乳酸菌30℃厌氧培养箱中培养48 h后计数，酵母菌、霉菌、一般好氧性细菌、大肠杆菌置于30℃恒温培养箱中培养48 h后计数，所有微生物数据采用lg(cfu)·g-1of FM表示[18]。

1.4 数据处理

利用Excel 2016进行试验数据的基础整理与表格绘制，使用SAS 9.4进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，平均值间差异显著性用Duncan氏法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同添加剂对青贮饲料感官品质的影响

由表3可知，添加剂处理组的青贮饲料感官评分均高于CK，其中A2得分最高为19分，其芳香味较浓，茎叶结构保持良好；A3得分略低于A2，其有明显的芳香味；A1得分低于A3，其芳香味次于A3，茎叶结构稍有改变，但不明显；添加添加剂处理的青贮色泽与原料相似，烘干后呈淡褐色，A2，A3总体表现为1级(优良)，A1，CK表现为2级(尚好)。

表3 不同添加剂处理对青贮饲料感官品质评价结果Table 3 Evaluation results of sensory quality of silage in different additive treatments

2.2 不同添加剂对青贮饲料营养品质的影响

由表4可知，青贮60 d后，A1，A2和A3的DM含量均显著低于CK(P<0.05)。A1处理组的CP含量高于CK,A2和A3，各处理组同CK之间差异不显著。各处理组的OM含量从高到低分别为CK>A1>A2>A3，各处理组同CK相比差异不显著。各处理组的NDF含量从高到低依次为A3>CK>A1>A2，其中A2的含量显著低于A3(P<0.05)。A1，A2，A3的WSC含量显著低于CK(P<0.05)。

2.3 不同添加剂对青贮饲料发酵品质的影响

由表5可知，各添加剂处理组的pH值均显著低于CK(P<0.05)，且均低于4.2。A1,A3的LA含量显著低于CK(P<0.05)，A2的LA含量最高，为88.38 g·kg-1，显著高于CK,A1和A3(P<0.05)。A3的AA含量最低，为2.38 g·kg-1，显著低于CK,A1和A2(P<0.05)。A2,A3的BA含量均显著低于CK和A1(P<0.05)。A1，A3的总酸含量显著低于CK(P<0.05)，A2的总酸含量高于CK，但差异不显著；A2的LA/AA的比值最高，且显著高于CK(P<0.05)；各处理组的NH3-N含量均高于CK，其中A1和A3显著高于CK(P<0.05)。

表5 不同添加剂处理对青贮饲料发酵品质的影响Table 5 The effects of different additives on the fermentation quality of silage

2.4 不同添加剂对青贮饲料微生物数量的影响

由表6可知：青贮60 d开袋后，各处理组乳酸菌的数量均高于CK，但差异不显著，其中A3乳酸菌数量最多，为8.58(lg(cfu)·g-1FW)；酵母菌、霉菌及大肠杆菌均未检测到；A3中一般好氧性细菌的数量显著低于CK和A1(P<0.05)，且为最低，A2较CK一般好氧性细菌数量下降，但差异不显著。

表6 不同添加剂处理对青贮饲料微生物数量的影响Table 6 The effects of different additive treatments on the microbial population of silage

2.5 不同添加剂青贮饲料的V-Score评分

由表7可知,A1，A3组氨态氮/总氮显著高于CK(P<0.05)，A2，A3组乙酸+丙酸的含量小于0.5%，各处理组的丁酸含量均在0.5%以下，其中A2的丁酸含量最低，计算得到的V-Score评分值最高，为86.26分，评分等级为良好。

表7 不同添加剂青贮饲料的V-Score评分Table 7 V-Score scores of different additive silages

3 讨论

3.1 不同添加剂处理对青贮饲料感官品质的影响

感官评价方法简洁易行，由于不需要任何仪器设备，所以在生产应用中比较常见[19]。高品质的青贮料在嗅觉上具有酸香味，不仅茎、叶结构保存较完整，而且在颜色上也呈现黄绿色，与原料较接近[19]。本研究结果表明，添加外源添加剂的各处理组青贮饲料感官评分均高于CK，其中A2,A3感官品质均评价为优良。说明在调制青贮饲料时，添加剂的介入能明显改善青贮饲料的感官品质。

3.2 不同添加剂处理对青贮饲料营养品质的影响

营养成分是反映饲草利用价值的重要指标[18]。在青贮过程中，由于参与发酵进程的乳酸菌需要水分来促进其生长和繁殖，所以DM含量对青贮发酵有很大影响[20]。在本研究中，随着添加剂的加入，各处理组DM含量均显著低于CK，说明在青贮发酵过程中DM均有损耗，有研究表明，在青贮发酵的有氧阶段，有氧微生物的生长而带来的DM损失通常是不可避免的[21]，这也是由于乳酸菌和纤维素酶都是促进发酵型添加剂，在发酵进程中乳酸菌和纤维素酶会使青贮饲料迅速发酵，因而增加了对DM的消耗。NDF是反映饲料纤维质量优劣的关键指标之一，其含量高低在实际生产应用中可作为估测奶牛日粮精粗比是否合适的重要依据[18]。A2处理组的NDF含量低于对照组，这可能是微生物发酵将纤维素分解形成挥发性脂肪酸[22]。在青贮料中添加含有纤维素酶成分的添加剂有助于促进植物细胞壁的快速分解，从而使植物纤维成分含量下降，改善牧草的营养价值，进一步提高其利用价值[23]。司丙文等[23]研究发现添加酶菌复合制剂有助于NDF的降解，在本试验中A2处理组NDF含量最低，此研究结果与其研究结果保持一致。A3处理组中加入添加剂后NDF含量上升，这与丁武蓉等[24]研究结果不一致，可能是由于青贮原料与添加剂中乳酸菌种类不同有关。WSC是产生乳酸以降低酸碱度的乳酸菌生长过程中的重要底物[20]，在本研究中各处理组的WSC含量显著低于对照组，说明外源添加剂的加入提高了乳酸菌在发酵进程中对底物的利用效率，其中A1处理组的WSC含量显著最低，说明加入乳酸菌添加剂后，乳酸菌在发酵过程中利用了更多的WSC作为底物去调控整个发酵过程，导致A1处理组的青贮料中剩余的WSC含量较少，这与刘辉等[25]研究结果一致。

3.3 不同添加剂处理对青贮发酵品质的影响

添加剂是影响青贮发酵品质的关键要素，不同的添加剂处理，青贮料的品质也不相同[26]。在本研究中，随着添加剂的加入，与对照相比，各处理组pH值显著降低，且均低于4.2，说明各添加剂处理有效的改善了黑麦草青贮的发酵品质。其中A2处理组pH值最低，主要是由于纤维素酶对青贮料细胞壁的破坏作用，使细胞内容物顺利流出，保证乳酸菌发酵时底物充足，使得乳酸菌充分发酵从而产生大量的乳酸以降低pH值，从而进一步提高发酵品质[24]，丁武蓉等[24]也得到相同的研究结果。V-Score评分体系是评价青贮饲料发酵品质常用且重要方法之一[25]，PA作为青贮饲料中重要的挥发性脂肪酸，其具有抗真菌的作用，能够有效的抑制青贮料的好氧腐败，有利于保存青贮饲料营养成分[27]。本研究中，各处理组的PA含量均高于对照组，且A2组的PA含量最高，BA含量显著低于其他处理组及对照组，且为最低；A2组中总酸的含量高于对照组，但差异不显著，王继成等[28]研究也提出，随着酶量的增加，青贮饲料中总有机酸含量有提高的趋势，本试验结果与其基本一致。本试验中，A2组中LA含量显著高于CK及其他处理组，且V-Score评分最高，等级为良好，说明A2组的发酵品质最好。青贮饲料中NH3-N的产生主要由于植物酶对蛋白质的降解和微生物分解利用蛋白质和氨基酸共同作用的结果[24]，以此来反映青贮料中蛋白质的降解程度。A1处理组中，AA含量上升，LA含量下降，这可能与异型发酵中乳酸菌发酵将LA一部分转化为AA的发酵特性有关[29]，AA含量的升高对提高青贮饲料的有氧稳定性起着至关重要的作用[30]。前人研究表明，AA和PA均能抑制好气菌生长引起的青贮料腐败变质[31]。

3.4 不同添加剂处理对青贮饲料微生物数量的影响

青贮料中乳酸菌的数量多少直接影响青贮发酵品质好坏，乳酸菌的生命代谢活动是青贮能否成功发酵的重要因素之一[18,32-33]。在本研究中，随着添加剂的加入，乳酸菌的含量均高于对照组，与陈雷等[34]研究结果一致。各处理组中，A2组与A3组一般好氧性细菌数量均低于对照组，有害微生物数量的降低从某种程度上减少了青贮饲料的耗氧腐败，减少了DM的损失[35]，提高了发酵品质。

4 结论

研究发现，3种添加剂对黑麦草青贮发酵品质以及微生物数量都有不同程度的改善，A2组的感官评定为优良，V-Score评分等级为良好，乳酸菌数量最多，一般好氧性细菌数量最少；为了提高黑麦草青贮饲料的感官品质、营养品质和发酵品质同时减少发酵过程中有害微生物的数量，增加有益微生物数量，在制作青贮饲料时添加复合菌剂(乳酸菌+纤维素酶)的效果最好。