添加剂对紫花苜蓿青贮品质及小肠可吸收氨基酸的影响

张海铉，霍文婕，陈 雷，刘 强，张拴林，王 聪，许庆方，郭 刚

(山西农业大学动物科学学院，山西 太谷 030801)

紫花苜蓿蛋白质含量高，是反刍动物的优质粗饲料。青贮是紫花苜蓿主要的加工贮藏手段之一，但紫花苜蓿缓冲能值高，可溶性碳水化合物含量低，青贮难以成功[1]。补充添加剂是解决紫花苜蓿青贮问题的有效手段。近年来，乳酸菌添加剂已经在苜蓿青贮生产中广泛应用，可提高青贮发酵品质[2]。并且同型发酵乳酸菌的青贮效果优于异型发酵乳酸菌，这是由于同型发酵以产生乳酸为主，可迅速降低pH值，抑制不良微生物的生长，提高青贮营养价值[3]。添加乳酸菌还可以减少青贮过程中蛋白质和氨基酸的分解，进而减少氨态氮(Ammonia nitrogen，NH3-N)的生成，降低干物质(Dry matter，DM)损失[4-5]。

单宁是一种植物次级代谢产物，多酚羟基化学结构及性质使其具有较强的抑菌和抗病毒作用。添加单宁可以提高青贮饲料的发酵品质，Ka-malak等[6]发现添加橡木缩合丹宁能够降低苜蓿青贮中乙酸、丁酸浓度，提高乳酸和丙酸浓度，改善苜蓿青贮的发酵品质。李成云等[7]发现紫花苜蓿青贮中添加榛子(Hazelnut)叶缩合单宁迅速降低青贮pH值，增加青贮乳酸含量，减少发酵过程中营养物质损失，提高青贮发酵的品质。单宁还具有与蛋白质结合，减少蛋白质分解的作用。研究发现，在瘤胃pH值为5～7时，单宁可以降低瘤胃蛋白表面活性，从而保护蛋白质在瘤胃中不易被降解[8]，增加机体氮的利用效率[9]。另外，在青贮过程中，单宁与乳酸菌组合添加具有一定的协同作用[10]，从而为单宁在动物饲草料加工中的应用提供了新的研究思路。

氨基酸是蛋白质的基本单位，若日粮中氨基酸组成符合动物营养需要，则可显著提高动物生长效率、减少废物排出，对环境保护具有重要意义，但由于日粮组成变化较大以及瘤胃微生物的作用，使得目前还无法准确评估反刍动物氨基酸的营养需要及生物学价值[11]。幼龄反刍动物的消化系统类似于单胃动物，瘤胃功能尚未健全，所需要的营养物质，如氨基酸必须从日粮中获得，因而氨基酸组成及供给十分重要。紫花苜蓿蛋白质含量高，氨基酸种类齐全[12]，可为反刍动物提供必需氨基酸。紫花苜蓿青贮中使用添加剂可抑制蛋白质降解，提高发酵品质，为动物机体提供更为丰富的氨基酸。郭旭升等[13]研究发现添加甲酸可以有效抑制紫花苜蓿青贮中蛋白质的降解，提高总氨基酸含量。

目前，关于乳酸菌和单宁作为青贮添加剂的研究，主要集中在降低苜蓿青贮饲料干物质和蛋白质损失，以及粗蛋白质构成方面，对于青贮饲料中的氨基酸组分变化及小肠可吸收氨基酸含量的影响研究较少。苜蓿青贮已经成为奶牛日粮的重要组成部分，氨基酸平衡，特别是必需氨基酸的供给对于奶牛生产性能的提升至关重要。为此，本试验通过紫花苜蓿青贮添加缩合单宁(葡萄籽单宁)和复合乳酸菌，研究添加剂对紫花苜蓿青贮饲料发酵品质、营养价值及小肠可吸收氨基酸组成的影响，以期为紫花苜蓿青贮生产中添加剂的应用和反刍动物氨基酸营养理论提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验设计

试验设四个处理组：对照组(CK)；复合乳酸菌组(戊糖乳杆菌+戊糖片球菌+乳酸片球菌，1∶1∶1，L)；葡萄籽单宁组(G)；复合乳酸菌+单宁酸组(LG)。葡萄籽单宁购置于润泽生物科技有限公司，纯度97%；戊糖乳杆菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌为实验室自有菌株。处理组复合乳酸菌的添加量为106cfu·g-1鲜重(Fresh weight，FW)，葡萄籽单宁添加量为3%干物质(Dry matter，DM)。葡萄籽单宁添加量参考Tabacco等[8]报道紫花苜蓿青贮中单宁添加量。同时，三种乳酸菌均能耐受此单宁浓度。

1.2 青贮制作

紫花苜蓿(品种‘SR 4030’)种植于山西农业大学动物科学学院试验站(112°35′25″E，37°25′08″N，海拔783 m)，于第二茬现蕾期刈割，留茬高度为5 cm，田间凋萎4.5 h至干物质含量在350 g·kg-1FW左右，用铡刀切碎至2 cm左右，并进行彻底混匀，取样分析其化学组分、微生物数量和氨基酸组分(表1)。试验添加所用乳酸菌，于试验前一天经分别活化后，置于恒温摇床上厌氧培养36 h，测定乳酸菌数量，按照菌落数量1∶1∶1混合，复合乳酸菌添加量达到106cfu·g-1FW；葡萄籽单宁添加量为3% DM，将其用蒸馏后溶解后均匀喷洒至紫花苜蓿；LG组两种添加剂按等体积进行添加，复合乳酸菌添加量为106cfu·g-1FW，葡萄籽单宁添加量为3% DM；对照组添加等体积的蒸馏水。将各处理组紫花苜蓿500 g放入带有单向排气阀的聚乙烯真空袋中，抽真空并密封，每组处理5个重复，至于环境温度(20℃～25℃)条件下保存。青贮60 d后开袋取样，分析其发酵指标。

表1 紫花苜蓿鲜样营养价值、附着微生物数量和氨基酸组成Table 1 Nutrient value,epiphytic microbial amount and amino acid contents of alfalfa

1.3 测定指标及方法

取青贮后样品20 g，加入60 g蒸馏水完全浸没，4℃静置24 h，用四层滤布及快速滤纸过滤，得到青贮浸提液，用于测定pH值、乳酸、挥发性脂肪酸(Volatile fatty acid，VFA)和氨态氮(NH3-N)。pH值采用pH计(梅特勒-托利多仪器有限公司LE438型)测定；乳酸含量采用对羟基联苯比色法测定[14]；VFA含量采用气相色谱仪(GC-TRACE 1300，色谱柱型号为30 m×0.25 mm×0.25 μm)测定[15]；NH3-N含量采用苯酚-次氯酸钠比色法[16]测定。中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber，ADF)含量采用Van Soest方法利用滤袋技术测定[17]。采用体外三步法[18]测定蛋白质及氨基酸小肠消化率。简要步骤为晨饲前采集3头瘤胃瘘管荷斯坦奶牛的瘤胃液，经4层滤布过滤至39℃保温瓶中，将瘤胃液与人工唾液(按照Longland等[19]描述的方法配制)按照1∶1充分混匀，并持续通入CO2保持厌氧环境，以维持瘤胃微生物的活性。称取新鲜青贮发酵样品1 g于发酵瓶中(体积为120 mL)，加入90 mL发酵液，每个处理组3个重复，同时设置3个空白组(只有发酵液)，将发酵瓶置于恒温水浴摇床中发酵16 h，模拟瘤胃发酵[20]后，测定发酵液pH值、NH3-N和VFA浓度，同青贮浸提液测定方法。称取瘤胃发酵后饲料残渣，先经过胃蛋白酶(1 g·L-1，Sigma P-7012)处理(38℃震荡水浴1 h)，再经过胰酶(3 g·L-1，Sigma P-7545)作用(38℃震荡水浴24 h)，然后加入三氯乙酸溶液终止酶反应，沉淀未消化蛋白。发酵后的饲料残渣，采用冷冻干燥法测定体外干物质降解率(DMD)及各氨基酸组分含量。氨基酸分析前处理根照GB/T18246-2019[21]酸水解法进行，采用全自动氨基酸分析仪(Biochrom 30+)[22]测定，流动相流速25 mL·h-1，茚三酮流速20 mL·h-1，进样量为20 μL，脯氨酸在波长440 nm处测定，其它种类氨基酸在570 nm波长下进行测定。

1.4 数据统计

试验数据采用GLM(SAS 9.0)进行复因子方差分析。各处理组之间均值差异采用Tukey’s多重比较检验，以P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 添加剂对紫花苜蓿青贮发酵特性及各氨基酸组分的影响

如表2所示，与对照组相比，添加复合乳酸菌组显著增加了青贮饲料中粗蛋白含量(P<0.05)，显著降低了丁酸含量(P<0.05)。与对照组比，添加葡萄籽单宁组及两者组合添加组均显著降低了青贮饲料中乳酸、乙酸、丁酸、总挥发酸及氨态氮含量(P<0.05)，而添加葡萄籽单宁单独组显著增加了青贮饲料干物质及粗蛋白含量(P<0.05)。与单独添加复合乳酸菌组相比，两种添加剂组合添加显著提高了青贮饲料乳酸/乙酸比值(P<0.05)，显著降低了青贮饲料中乙酸、丁酸、总挥发酸、氨态氮及粗蛋白含量(P<0.05)。与单独添加单宁组相比，两者组合添加显著提高了青贮饲料中乳酸/乙酸比值(P<0.05)，显著降低了青贮饲料中的乙酸、总挥发酸、氨态氮及粗蛋白的含量(P<0.05)。各添加剂处理组对青贮饲料丙酸、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量没有显著影响。

表2 复合乳酸菌和葡萄籽单宁对紫花苜蓿青贮饲料发酵参数和营养价值的影响Table 2 Effect of compound lactic acid bacteria and grape seed tannins on fermentation parameters and nutrient value of alfalfa silage

如表3所示，除Val外，青贮饲料必需氨基酸含量均受到复合乳酸菌添加的显著影响(P<0.05)，而非必需氨基酸只有Gly和Cys受到复合乳酸菌添加的显著影响(P<0.05)；葡萄籽单宁添加显著影响青贮饲料除Met，Phe和Val外的所有必需氨基酸，以及非必需氨基酸中的Ser和Cys含量(P<0.05)；两者组合添加除对青贮饲料Met，Phe，Ser，Glu和Pro含量没有交互效应外，其余氨基酸均存在交互效应(P<0.05)。与对照组相比，复合乳酸菌添加显著增加了紫花苜蓿青贮饲料必需氨基酸组分中的Met含量和非必需氨基酸组分中Asp和Cys含量(P<0.05)，而Ile，Tyr和Thr含量显著降低(P<0.05)；葡萄籽单宁添加显著提高了青贮饲料必需氨基酸组分中的Ile，Leu，Lys，His，Arg，Tyr含量(P<0.05)和非必需氨基酸组分中的Asp，Ser，Ala，Cys含量(P<0.05)，同时TAA含量显著提高(P<0.05)；两种添加剂组合添加显著提高了青贮饲料Cys含量(P<0.05)，而Tyr和Thr含量显著降低(P<0.05)。

表3 复合乳酸菌和葡萄籽单宁对紫花苜蓿青贮饲料氨基酸组成的影响Table 3 Effect of compound lactic acid bacteria and grape seed tannins on amino acid contents of alfalfa silage 单位：g·kg-1DM

2.2 添加复合乳酸菌及葡萄籽单宁青贮对体外瘤胃发酵特性及小肠可吸收氨基酸的影响

如表4所示，复合乳酸菌添加显著提高青贮饲料干物质降解率(P<0.05)，葡萄籽单宁添加显著提高瘤胃微生物蛋白产量(P<0.05)。

表4 复合乳酸菌和葡萄籽单宁对紫花苜蓿青贮饲料体外瘤胃发酵参数的影响Table 4 Effect of compound lactic acid bacteria and grape seed tannins on rumen fermentation parameters of alfalfa silage in vitro

如表5所示，与对照组相比，添加复合乳酸菌显著提高青贮饲料Cys以及TAA的小肠吸收量(P<0.05)；葡萄籽单宁添加提高青贮饲料His，Arg，Ser，Glu，Cys和TAA的小肠可吸收量(P<0.05)；两者组合添加显著提高青贮饲料中Glu和Cys的小肠可吸收量(P<0.05)。

表5 复合乳酸菌和葡萄籽单宁对紫花苜蓿青贮饲料小肠可吸收氨基酸组成的影响Table 5 Effect of compound lactic acid bacteria and grape seed tannins on the contents of absorbable amino acids in the small intestine of alfalfa silage 单位：g·kg-1DM

3 讨论

3.1 复合乳酸菌和葡萄籽单宁对紫花苜蓿青贮饲料发酵特性的影响

青贮是复杂的微生物发酵过程，受多因素调控[23]，为提高青贮品质，复合添加剂的应用也越来越广泛。添加单宁可抑制不良微生物对碳水化合物和蛋白质的利用，提高饲料营养价值[24]，本研究中添加葡萄籽单宁使苜蓿青贮饲料pH值，VFA及NH3-N含量显著降低，减少营养物质损失。单宁种类及乳酸菌种类的选择是影响单宁调控乳酸菌的因素[25]。葡萄籽缩合单宁对乳酸菌具有一定抑制作用[26]，本研究中葡萄籽单宁添加显著降低青贮饲料中的乳酸含量，抑制乳酸菌生长代谢。青贮过程中NH3-N的生成主要是由于植物和微生物蛋白酶对饲料蛋白质的降解作用。单宁具有一定抑制蛋白降解的作用[27]，本研究中葡萄籽单宁单独或组合添加均能显著降低青贮饲料的NH3-N含量，抑制蛋白质降解。本研究中所选乳酸菌均为前期菌株筛选鉴定过程中产酸特性较好的菌株，但复合乳酸菌处理组青贮饲料的pH值和NH3-N含量与对照组无显著性差异，这可能是由于青贮原料中水溶性碳水化合物含量较低，而附着乳酸菌数量较高，本研究中青贮原料附着乳酸菌达到105cfu·g-1FW以上。Muck等[28]证实青贮材料附着乳酸菌数量达到105cfu·g-1FW以上，乳酸菌外源添加剂的作用有限。另外，植物蛋白水解酶在pH值为5.0～6.0[29]范围内表现出较高的活性。因此，复合乳酸菌添加并未表现出明显的pH值和NH3-N变化。丁酸是蛋白质、葡萄糖和乳酸被腐败菌等有害微生物分解所产生的，本试验中紫花苜蓿经田间凋萎后，干物质含量达到350 g·kg-1，青贮原料水分活度降低，抑制梭菌生长[30]。葡萄籽单宁添加组丁酸含量显著降低，是由于单宁具有强烈的抑菌作用，抑制了梭菌的生长，从而减少了丁酸产生。

葡萄籽单宁的添加显著提高了青贮饲料的干物质含量，这与其抑制不良微生物作用有关。与紫花苜蓿原料相比，各添加剂处理组的蛋白质含量略有增加，其原因可能是复合乳酸菌及葡萄籽单宁对蛋白质具有一定的保护作用，而乳酸菌发酵过程中利用可溶性碳水化合物[31]，产生了挥发性物质，干物质含量减少，使青贮饲料中蛋白质含量相对增加。与对照组相比，单宁添加剂组增加了青贮饲料中粗蛋白质的含量。这是由于单宁与蛋白质可以形成复合物，从而抑制植物和微生物蛋白的降解[32]。复合乳酸菌添加同样显著提高了青贮饲料的粗蛋白质含量，然而两种添加剂组合应用并未显示良好的效果，可能是紫花苜蓿青贮中添加单宁抑制乳酸菌的生长，使得两种添加剂组合添加应用不具备相互促进作用[33]。所有处理组的NDF和ADF含量无显著性差异，这与徐生阳等[34]的研究结果一致，说明添加复合乳酸菌及葡萄籽单宁有利于紫花苜蓿青贮营养物质的保存。

紫花苜蓿青贮过程中蛋白质降解主要是由于植物蛋白酶和微生物的作用。本试验青贮饲料Arg被大量分解，其他氨基酸也有不同程度的降低，但Gly，Ala，Pro和Leu增加，这是青贮过程中植物蛋白酶的降解作用和微生物蛋白合成的共同作用[35]。葡萄籽单宁处理组的TAA含量最高，这是由于葡萄籽单宁与蛋白质形成稳定的复合物，阻碍了蛋白酶的分解作用。复合乳酸菌与葡萄籽单宁组合处理组的TAA含量低于单独添加葡萄籽单宁组，与上述蛋白质含量结果一致。与对照组相比，复合乳酸菌添加可以提高青贮饲料中的Cys含量，而对其他氨基酸没有影响，这可能与乳酸菌菌种代谢[36]有关，有待于进一步研究。

3.2 复合乳酸菌和葡萄籽单宁对紫花苜蓿青贮饲料体外瘤胃发酵特性及小肠可吸收氨基酸的影响

瘤胃液pH值是评定瘤胃内环境是否稳定的重要指标[37]。各处理组瘤胃液pH值均在正常值6.2～7.0范围内[38]。对于体外发酵体系，青贮饲料底物有限，通常难以影响瘤胃pH值[39]。本试验中添加葡萄籽单宁提高瘤胃MCP的产量，添加单宁减缓蛋白及碳水化合物的降解，为瘤胃微生物提供更多营养成分[40]。瘤胃干物质降解率是影响干物质采食量的重要因素[41]。本试验中添加复合乳酸菌显著提高了干物质降解率，乳酸菌有助于瘤胃其他有益菌的生长[42]，从而提高饲料营养物质在瘤胃内的降解[43]，陈雷等[33]也得出相似研究结果。葡萄籽单宁处理组干物质降解率最低，与其具有一定的抑制微生物生长的作用有关。

蛋白质的利用效率与小肠可吸收氨基酸含量和组成有关。在反刍动物新蛋白体系中，小肠可吸收氨基酸用以评价饲料蛋白质的营养价值[44]。小肠可吸收氨基酸主要来源于瘤胃微生物蛋白和饲料非降解蛋白质[45]，提高小肠可吸收氨基酸含量有利于提高反刍动物的生产性能。在pH值为5～7时，缩合单宁可与蛋白质结合，降低瘤胃蛋白表面活性，从而保护蛋白质在瘤胃中不易被降解[8]，还可以增加瘤胃液的黏性，减少泡沫和胃胀气的产生，增加机体氮的利用效率[9]。葡萄籽单宁处理组小肠可吸收氨基酸含量最高，这是由于在瘤胃中葡萄籽单宁与植物蛋白质形成稳定复合物，抑制瘤胃微生物的分解作用，并且在酸性条件下不易被分离，使得过瘤胃蛋白质增多，到达小肠的蛋白质总流量增加，从而促进小肠对氨基酸的吸收效率[8,46]。单独添加葡萄籽单宁可以提高小肠可吸收Lys和Arg的含量，可能与葡萄籽单宁提高胰蛋白酶活性有关，使得肽链内切酶水解两种氨基酸之间的肽键[47]。添加剂处理组均提高了小肠可吸收Cys和Glu的含量，这是由于添加复合乳酸菌及葡萄籽单宁提高了青贮饲料中两者的含量，同时还可能通过影响瘤胃内微生物群系提高两种氨基酸的吸收量[48-49]。紫花苜蓿添加葡萄籽单宁青贮后，提高了青贮饲料中Lys，His等多种必需氨基酸含量，从而增加了小肠可吸收必需氨基酸的含量，对于提高反刍动物蛋白质利用和生产性能具有积极作用。

4 结论

本研究结果表明，单独添加葡萄籽单宁以及葡萄籽单宁与乳酸菌组合添加可以降低紫花苜蓿青贮饲料中乙酸、总挥发性脂肪酸和氨态氮的含量，对青贮饲料发酵品质具有一定的改善作用，但乳酸含量降低；而单独添加乳酸菌对青贮饲料发酵品质的改善作用效果有限；单独添加葡萄籽单宁或乳酸菌，青贮饲料总氨基酸含量均显著提高；添加葡萄籽单宁还可以显著提高体外发酵微生物菌体蛋白合成量，以及小肠可吸收异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，组氨酸，精氨酸，酪氨酸和总氨基酸含量。因此，添加葡萄籽单宁在一定程度上改善了紫花苜蓿青贮饲料发酵品质和营养价值，且明显提高了青贮饲料中必需氨基酸赖氨酸、组氨酸和精氨酸，以及总氨基酸的小肠可吸收量。