黄芪多糖对糖尿病心肌病大鼠AMPK-mTOR通路的调控机制研究

叶婷 马国庆 魏明慧 陈晶

摘要 目的：研究黄芪多糖对糖尿病心肌病（DCM）大鼠的干预作用，阐明黄芪多糖对糖尿病心肌病大鼠心肌AMPK-mTOR信号通路的影響，探讨黄芪多糖对糖尿病心肌病大鼠心肌的保护作用。方法：80只健康雄性SD大鼠，随机选取10只作为对照组，其余70只采用高糖高脂饮食联合链脲佐菌素腹腔注射复制DCM模型。将模型复制成功的大鼠随机分为模型组、黄芪多糖组、氯喹组、黄芪多糖+氯喹组。连续给药8周后，超声心动图评价大鼠的心脏功能，HE染色观察心肌组织的病理变化，Masson染色检测大鼠心肌纤维化程度，蛋白质印迹法测定心肌组织中AMP活化蛋白激酶（AMPK）、p-AMPK、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p-mTOR蛋白的表达，实时PCR检测心肌组织AMPK、mTOR mRNA的表达情况。结果：与对照组比较，模型组大鼠左室收缩末内径（LVESD）、左室舒张末内径（LVEDD）、mTOR蛋白、p-mTOR蛋白、mTOR mRNA明显升高，左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）、AMPK、p-AMPK、AMPK mRNA明显降低（均P<0.01）。与模型组比较，黄芪多糖组组LVEDD、LVESD、mTOR蛋白、p-mTOR蛋白明显降低，LVEF、LVFS、AMPK蛋白、p-AMPK蛋白明显升高（均P<0.01）。与黄芪多糖组比较，黄芪多糖组+CQ组大鼠心肌p-AMPK蛋白、AMPK mRNA水平明显降低，mTOR、p-mTOR、mTOR mRNA水平明显升高（P<0.05，P<0.01）。结论：黄芪多糖能调节AMPK-mTOR信号通路上相关蛋白及的mRNA表达，激活AMPK-mTOR信号通路，进而发挥对糖尿病心肌病的保护作用。

关键词 黄芪多糖;链脲佐菌素;糖尿病心肌病;糖脂代谢;心肌肥厚;AMP活化蛋白激酶;哺乳动物雷帕霉素靶蛋白;信号通路

Regulation Mechanism of Astragalus Polysaccharides on Diabetic Cardiomyopathy Rats by AMPK-mTOR Pathway

YE Ting1，MA Guoqing1，WEI Minghui1，CHEN Jing2

（1 The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150001，China; 2 Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

Abstract Objective：To study the effect of astragalus polysaccharides（APS） on diabetic cardiomyopathy（DCM） rats，clarify the effect of APS on AMPK-mTOR signaling pathway in DCM rats，and explore the protective effect of APS on DCM rats.Methods：A total of 80 healthy male SD rats were selected.Ten of the rats were randomly divided into a control group.The other 70 rats were fed with high-sugar and high-fat diet，and intraperitoneally injected streptozotocin（STZ） to induce and duplicate DCM model.The rats with DCM model were randomly divided into a model group，an APS group，a chloroquine group，and an APS+chloroquine group.After treatment for 8 weeks，echocardiography was used to evaluate the cardiac function of rats，and hematoxylin-eosin（HE） staining was used to observe the pathological changes of myocardial tissue.Masson staining was used to detect the degree of myocardial fibrosis，and Western blot was used to detect the protein expressions of adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase（AMPK），phosphorylated-AMPK（p-AMPK），mammalian target of rapamycin（mTOR），and phosphorylated-mTOR（p-mTOR），and real-time quantitative polymerase chain reaction（real-time PCR） was used to detect the messenger ribonucleic acid（mRNA） expressions of AMPK and mTOR.Results：Compared to the control group，left ventricular end diastolic dimension（LVEDD），left ventricular end systolic diameter（LVESD），proteins of mTOR and p-mTOR，and mRNA of mTOR in the model group were significantly increased，while left ventricular ejective fraction（LVEF），left ventricular fraction shortening（LVFS），proteins of AMPK and p-AMPK，and mRNA of AMPK were significantly decreased（P<0.01）.Compared with the model group，LVEDD，LVESD，proteins of mTOR and p-mTOR in the APS group were significantly decreased，while LVEF，LVFS，proteins of AMPK and p-AMPK were significantly increased（P<0.01）.Compared with the APS group，protein of p-AMPK and mRNA of AMPK in the APS+chloroquine group were significantly decreased，while proteins of mTOR，p-mTOR and mRNA of mTOR were significantly increased（P<0.05，P<0.01）.Conclusion：APS regulated the expression of related proteins and mRNA in AMPK-mTOR signaling pathway，and activated AMPK-mTOR signaling pathway，thus playing a protective role in DCM.

Keywords Astragalus polysaccharides; Streptozotocin; Diabetic cardiomyopathy; Glycometabolism; Cardiac hypertrophy; Adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase; Mammalian target of rapamycin; Signaling pathway

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.07.014

糖尿病心肌病（Diabetic Cardiomyopathy，DCM）是临床中糖尿病最为常见的并发症之一，主要是指发生于糖尿病病患，而不依赖于高血压心脏病、瓣膜性心脏病、冠心病及其他心脏病变来解释的心肌疾病[1-2]。其发病率高，危险性大，是糖尿病患者主要死亡原因之一[3]。DCM的发病机制是在代谢紊乱、微血管病变基础上引起心肌微血管损伤、血管周围及间质发生纤维化等病理学改变，从而出现亚临床心功能异常，最终进展为心律失常、心源性休克及心力衰竭，重症患者甚至猝死[4]。腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMP-actived Protein Kinase，AMPK）是重要的“能量調节器”，主要作用是感受细胞能量状态的变化，当机体内出现缺血、缺氧以及氧化应激时，AMPK则会被激活[5]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）是AMPK下游的重要信号分子，是调节自噬的关键蛋白，激活的AMPK能抑制mTOR，进而调节自噬[6]。对糖尿病心肌病动物模型进行观察[7]，发现自噬被抑制，说明自噬的抑制将导致糖尿病心肌病[8]，而抑制AMPK，mTOR被激活，轻链3（Light Chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）表达增强，将激活自噬[9]。相关研究已证实黄芪多糖（Astragalus Polysaccharides，APS）对糖尿病及其并发症均有防治作用，能降低血糖、血脂等指标水平，增加胰岛素敏感性，调节心肌能量代谢，减轻心肌组织损伤，可抑制心肌细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）积聚和心肌纤维化，恢复心肌功能，减轻大鼠心肌损伤[10]。综上所述，AMPK-mTOR在DCM中起重要作用，但黄芪多糖是否通过AMPK-mTOR介导发挥对DCM模型大鼠心肌损伤的调节作用尚不明确。为此，本实验用SD大鼠复制DCM模型，设计实验观察黄芪多糖组对DCM模型大鼠AMPK-mTOR信号通路的影响，从糖脂代谢、心脏功能、病理学形态、分子蛋白水平探讨黄芪多糖组治疗DCM的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级健康雄性6周龄Sprauge-Dawley（SD）大鼠80只，体质量（180±20）g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK（黑）2016-004。实验室的室内温度为（22±2）℃，相对湿度（55±10）%，自然采光，大鼠饲养在动物笼内，垫料为清洁木屑，以大鼠标准饲料进行喂养，自由饮食及饮水。实验方案经黑龙江中医药大学实验动物管理和使用委员会批准（伦理审批号：2018092601）。

1.1.2 药物 黄芪多糖（西安瑞林生物科技有限公司，批号：RL20150412）;氯喹（Sigma公司，美国，批号：C6628-25G）;链脲佐菌素（Streptozocin，STZ，Sigma公司，美国，批号：S0130-1g）。

1.1.3 试剂与仪器 AMPK抗体（货号：ab131512）、p-AMPK抗体（货号：ab23875）、mTOR抗体（货号：ab32028）、p-mTOR抗体（货号：ab109268），以上均购自英国Abcam公司。电子天平（METTLEY TOLEDO公司，瑞士，型号：AL204），超声显像仪（SIEMENS公司，德国，型号：SEQUOIA512），酶标仪（Bio-Rad公司，美国，型号：iMark），低温离心机（Thermo公司，美国，型号：ST8）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将80只SD大鼠适应性喂养1周后，随机选取10只作为对照组，其余70只给予高糖高脂饲料（基础料66.6%、蔗糖20%、猪油10%、胆固醇2.5%、胆酸钠1%;脂肪含量比35%，总热3.95 kcal/g）喂养4周后，按30 mg/kg体质量腹腔注射链脲佐菌素（0.1%柠檬酸缓冲液，pH4.5）。1周后尾部取血测空腹血糖（大于16.7 mmol/L），并出现多饮、多尿症状视为2型糖尿病模型造模成功。糖尿病模型制备成功后，继续饲养8周后，随机选取2只大鼠处死，进行心肌组织的苏木精-伊红染色（Hematoxylin and Eosin Staining，HE staining）及透射电镜，如心肌细胞出现排列紊乱、细胞肥大、线粒体肿胀等变化，则说明其出现心肌损伤，表明DCM大鼠模型复制成功[11-12]。将DCM大鼠随机分为4组：模型组、黄芪多糖组、氯喹组、黄芪多糖+氯喹组。

1.2.2 给药方法 分组后对各组大鼠灌胃给药，给药量按人与大鼠给药剂量系数折算公式，同时参考相关文献[13]，具体给药剂量如下：黄芪多糖组按照800 mg/（kg·d）剂量灌胃给药黄芪多糖;氯喹组按照25 mg/（kg·d）剂量腹腔注射氯喹;黄芪多糖+氯喹组同时给予800 mg/（kg·d）剂量灌胃给药黄芪多糖和25 mg/（kg·d）剂量腹腔注射氯喹;对照组等容积生理盐水灌胃;模型组等容积生理盐水灌胃。1次/d，共8周。实验过程中有个别鼠因血糖过高不耐受而死亡，共剩余55只。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 超声心动图 造模后及治疗后对各组大鼠行超声心动图检查，10%水合氯醛溶液0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后将其仰卧位固定在操作台上，胸前备皮，利用小动物超声仪（探头频率为14 MHz），沿胸骨旁左心长轴切面进行检查，测左室收缩末内径（Left Ventricular End Systolic Diameter，LVESD）、左室舒张末内径（Left Ventricular End Diastolic Diameter，LVEDD），连续测量3个心动周期取平均值，按照Teichholtz公式计算左心室射血分数（Left Ventricular Ejection Fraction，LVEF）、左心室短轴缩短率（Left Ventricular Fractional Shortening，LVFS），用于评价大鼠心脏功能。

1.2.3.2 心肌组织HE染色 将心室组织用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片后，脱蜡、入水，苏木精（Hematoxylin）染液染色，水洗，伊红（Eosin）染液染色，梯度乙醇脱水，透明，中性树脂封片，光镜下观察心肌病理改变情况，拍照。

1.2.3.3 心肌组织Masson染色 石蜡切片脱蜡至水，铬化处理或去汞盐沉淀，用Regaud苏木精染液染核，充分水洗，用Masson丽春红酸性复红液染色，苯胺蓝复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固玻片，光镜下观察心肌胶原的沉积情况，拍片并记录。

1.2.3.4 蛋白质印迹法检测心肌组织AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白的表达 冻存的心肌组织，提取总蛋白和细胞核蛋白。取50 μg蛋白进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳结束后以200 mA恒流，90 min为转膜条件将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（Polyvinylidenefluoride，PVDF）上，室温封闭2 h后，加入5%牛血清白蛋白以稀释抗体，4 ℃孵育过夜，三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris-buffered Saline，TBS）+吐溫（Tween）缓冲溶液洗膜4次，15 min/次，二抗稀释液室温孵育1 h，TBS+Tween缓冲溶液（TBST）洗膜4次，15 min/次，用ECL化学发光显色液，避光显影2 min，置于全自动化学发光图像分析系统扫描，检测AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白的表达情况。

1.2.3.5 实时聚合酶链反应（Real-time PCR）检测心肌组织AMPK、mTOR的表达 50 mg心肌组织放置1.5 mL的EP管中，加入TRIzol Reagent试剂（TRIzol），提取1 μL RNA，核酸蛋白分析仪测定RNA的浓度。取出10 μLRNA样本加到200 μL的PCR管中，将RNA反转录至cDNA，测量cDNA浓度。PCR管中分别加入cDNA模板及上下游引物，PCR仪设置好程序，进行PCR扩增，采用2-△△Ct法分析基因表达相对变化，整理并导出数据。Real-time PCR引物序列见表1。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件对实验数据进行分析，所有计量资料以均数±标准差（±s）表示。组间比较用单因素方差分析和配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪多糖对DCM大鼠超声心动图检查结果的影响 治疗后，与对照组比较，模型组大鼠LVEDD、LVESD明显升高，LVEF、LVFS明显降低，差异均有统计学意义（均P<0.05）。与模型组比较，黄芪多糖组LVEDD、LVESD明显降低，LVEF明显升高，差异均有统计学意义（均P<0.05）。见表2，图1。

2.2 黄芪多糖对DCM大鼠心肌组织病理学的影响  大鼠心肌组织切片HE染色结果显示，对照组心肌细胞排列整齐，无水肿、坏死等形态学改变，肌纤维排列紧密，横纹清晰可见，无炎症细胞浸润。而模型组可见心肌细胞肥大，排列紊乱，有肌纤维断裂、溶解、坏死等情况，有大量炎症细胞浸润。与模型组比较，黄芪多糖组、黄芪多糖+氯喹组虽然镜下仍可见病理学改变，但心肌细胞排列相对整齐，肌纤维结构较清晰，炎症细胞浸润程度有改善。氯喹组心肌细胞肥大，排列紊乱，肌纤维断裂、溶解、坏死，炎症细胞浸润较模型组加重。大鼠心肌组织切片Masson染色显示，对照组大鼠心肌细胞、血管之间可见少量胶原纤维;模型组可见明显的心肌细胞肥大、胶原纤维增生、排列紊乱、间质纤维化明显，图片中可见分布不均、相互连接形成网状的胶原纤维;与模型组比较，黄芪多糖组、黄芪多糖+氯喹组心肌胶原纤维增生减轻，细胞形态尚可。氯喹组心肌纤维化程度较模型组加重。见图2。

2.3 黄芪多糖对DCM大鼠心肌AMPK、p-AMPK蛋白表达的影响 治疗后，与对照组比较，模型组大鼠心肌AMPK、p-AMPK蛋白水平明显降低，差异均有统计学意义（均P<0.05）。与对照组比较，黄芪多糖组、黄芪多糖+氯喹组大鼠心肌AMPK、p-AMPK蛋白的水平明显升高，差异均有统计学意义（均P<0.05）。与黄芪多糖组比较，黄芪多糖+氯喹组大鼠心肌p-AMPK蛋白水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3，图3。

2.5 黄芪多糖对DCM大鼠心肌mTOR、p-mTOR蛋白表达的影响 治疗后，与对照组比较，模型组大鼠心肌mTOR、p-mTOR蛋白水平明显升高，差异均有统计学意义（均P<0.05）。与模型组比较，黄芪多糖组大鼠心肌mTOR、p-mTOR蛋白的水平明显下降，差异均有统计学意义（均P<0.05）。与黄芪多糖组比较，黄芪多糖+氯喹组大鼠心肌mTOR、p-mTOR蛋白水平明显升高，差异均有统计学意义（均P<0.05）。见表4，图4。

2.6 黄芪多糖对DCM大鼠心肌AMPK、mTOR mRNA表达的影响 治疗后，与对照组比较，模型组大鼠心肌AMPK mRNA表达水平明显降低，而mTOR mRNA表达水平明显升高，差异有统计学意义（均P<0.05）。与模型组比较，黄芪多糖组、黄芪多糖+氯喹组大鼠心肌AMPK mRNA表达水平明显升高，而mTOR mRNA表达水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与黄芪多糖组比较，黄芪多糖+氯喹组大鼠心肌AMPK mRNA表达水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表5，图5。

3 讨论

DCM目前的治疗主要从控制危险因素（强化降糖、降脂、降压）和抑制心脏重构2方面进行，预防心力衰竭进展和恶化[14]，但数据表明糖尿病患者的心血管事件发生进程并没有完全减少[15]。黄芪多糖是黄芪的主要活性成分之一，近年研究发现，其在调节免疫功能、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、延缓衰老等方面有较好的疗效[16-17]。相关研究已证实黄芪多糖对糖尿病及其并发症均有良好的防治作用，能增加胰岛素敏感性，调节心肌能量代谢，减轻心肌组织损伤，可抑制ECM积聚和心肌纤维化，恢复心功能，减轻大鼠心肌损伤等[18-20]。黄芪多糖干预心力衰竭小鼠模型表明，黄芪多糖能通过降低AMPK蛋白表达，增加mTOR表达，调节AMPK-mTOR通路，减轻阿霉素诱导的小鼠心力衰竭[21]。

本研究彩色多普勒超聲结果显示：与对照组比较，模型组大鼠的LVEDD、LVESD水平明显升高，LVEF、LVFS明显降低（均P<0.05），提示模型组大鼠未经药物干预，心脏功能存在明显改变，符合DCM的典型超声心动图特点。与模型组比较，黄芪多糖组组LVEDD、LVESD降低，LVEF、LVFS升高（均P<0.01），提示经黄芪多糖治疗后，DCM大鼠的心功能得到一定程度的改善。同时，实验结果表明，应用氯喹后，LVEDD、LVESD较模型组升高，LVEF、LVFS较模型组降低，说明氯喹对DCM大鼠的心功能有一定程度的影响。与黄芪多糖组比较，黄芪多糖+氯喹组LVEDD、LVESD降低，LVEF、LVFS升高，提示氯喹有部分抑制黄芪多糖改善心功能的作用，氯喹的应用能影响大鼠的心功能指标，影响黄芪多糖对心功能的改善作用。

本实验通过HE染色观察DCM大鼠心肌组织形态变化，Masson 3色染色，观察心肌间质内胶原纤维的沉积情况。光镜下可见模型组大鼠心肌细胞肥大，排列紊乱，有肌纤维断裂、溶解、坏死等情况，有大量炎症细胞浸润。Masson染色提示心肌细胞肥大，肌纤维排列紊乱，纤维化组织替代正常心肌组织，心肌间质胶原纤维明显增加，蓝染的纤维结缔组织将心肌肌束分隔包绕，提示DCM模型大鼠心肌组织发生严重损伤，且有纤维化发生。黄芪多糖和氯喹干预后，虽然镜下仍可见病理学改变，但心肌细胞排列相对整齐，肌纤维结构较清晰，炎症细胞浸润程度有改善，心肌细胞形态与肌纤维排列明显改善，其中黄芪多糖组改善最为明显，提示黄芪多糖能改善DCM大鼠心肌病理学变化，且黄芪多糖对DCM大鼠心肌保护作用可以被氯喹部分抑制。

本实验采用蛋白质印迹法检测心肌组织AMPK-mTOR通路上AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR的蛋白表达，发现DCM时，AMPK受到抑制，p-AMPK蛋白表达水平降低，mTOR被激活，p-mTOR蛋白表达水平升高，提示DCM时，AMPK-mTOR信号通路被抑制;黄芪多糖和氯喹应用后，AMPK、p-AMPK的蛋白表达水平均有不同程度提高，mTOR、p-mTOR蛋白的表达水平下降，提示黄芪多糖能促进AMPK-mTOR信号通路的激活。Real-time PCR检测心肌组织AMPK、mTOR的mRNA表达，模型组AMPK mRNA降低、mTOR mRNA升高，黄芪多糖和氯喹干预后，大鼠心肌组织中AMPK mRNA的水平均有不同程度的提高，而mTOR mRNA的水平降低，提示黄芪多糖能调节DCM大鼠AMPK-mTOR信号通路，氯喹可部分抑制黄芪多糖组对AMPK-mTOR信号通路的影响。

综上所述，本实验研究结果显示，黄芪多糖能调节AMPK-mTOR信号通路上相关蛋白的mRNA表达，激活AMPK-mTOR信号通路，进而发挥对DCM的保护作用。然而，黄芪多糖是否通过其他的信号通路改善DCM发挥作用仍有待进一步探索。明确其在DCM中的具体作用机制，将为黄芪多糖的临床应用提供理论依据，同时也为DCM的临床治疗提供新的思路。

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（2021-03-23收稿 本文编辑：张乐杰）