中国“槟榔黄化病”研究40年——病原、防控措施新进展
2022-06-02唐庆华孟秀利于少帅林兆威牛晓庆宋薇薇覃伟权
唐庆华 孟秀利 于少帅 林兆威 牛晓庆 宋薇薇 覃伟权
摘 要：自1981年海南省屯昌縣首次发现槟榔黄化病（yellow leaf disease of areca palm， YLD）以来，槟榔黄化问题日趋严重，现已成为制约中国槟榔产业可持续发展的最重要的因素。同时，鉴于生产中除槟榔黄化病外，炭疽病、细菌性叶斑病、椰心叶甲、干旱等一些其他因素也可引起槟榔黄化，以及“槟榔黄化病”病原或病因认识上存在混淆的问题，学界暂用“槟榔黄化现象”的表述。近年来，针对上述问题开展了一系列深入研究并取得突破性进展。本文首先简要回顾了中国槟榔黄化病的发生及病原方面的研究进展，介绍了另一种致黄关键新病害——由槟榔隐症病毒1（Areca palm velarivirus 1， APV1）引起的槟榔黄叶病毒病（areca palm leaf yellowing virus disease， ALYVD），以及其他2种新发现的病毒病害——槟榔坏死环斑病毒病和槟榔坏死环斑病毒病的研究进展。对6个示范基地的病原检测结果表明，部分黄化植株被槟榔黄化植原体（areca palm yellow leaf phytoplasma， AYLP）或APV1单独感染，部分植株被AYLP和APV1复合感染。本文还探讨了槟榔黄化病研究中存在的病原分布不均、含量低引起的检测困难和田间诊断易混淆等问题，并对YLD、ALYVD、叶斑类病害、根腐病害、芽腐病、椰心叶甲、干旱、寒害、除草剂药害等9类因子引起的黄化症状特征进行了总结。进而分析了YLD和ALYVD 防控中存在的问题以及现阶段面临的紧迫形势，从防控策略和具体措施解读了《槟榔“黄化病“防控明白纸》，并指出了其有待进一步完善之处及防控中亟待解决的问题。最后，展望了YLD和ALYVD 2种致黄关键病害综合防控中亟待实施的措施。本文旨在让广大科研工作者和农技人员更好地了解槟榔“黄化病”方面的最新成果。
关键词：槟榔黄化病（YLD）;槟榔黄化植原体;槟榔隐症病毒1;槟榔黄叶病毒病（ALYVD）;防控明白纸中图分类号：S436.67 文献标识码：A
Forty Years of Research on “Yellow Leaf Disease of Areca Palm” in China： New Progress of the Casual Agent and the Management
Abstract： Since yellow leaf disease of areca palm （YLD） was observed in Tunchang County， Hainan Province in 1981， issues regarding to areca palm leaf yellowing are increasingly serious which have become the most important factors restricting the sustainable development of the areca palm industry in China. Meanwhile， a temporary conception ‘areca yellow leaf phenomenon was proposed by the academic circle based on the facts that some other factors including areca anthracnose， areca bacterial leaf spot， coconut leaf beetle， and drought stress etc. except YLD could cause areca palm leaves to turn yellow and confusions were existed in the understanding of the causal agent or cause of ‘YLD. The questions above have been researched systematically and breakthroughs have been achieved recently. In this review， firstly， the occurrence and progress on the etiological agent of YLD were briefly retrospected， achievements of another key novel areca palm yellow leaf related disease， areca palm leaf yellowing virus disease （ALYVD） caused byAreca palm velarivirus 1（APV1）， together with 2 recently reported virus diseases areca palm necrotic spindle-spot virus disease and areca palm necrotic ringspot virus disease were introduced. Detection of the pathogens of diseased leaf samples showing yellow symptom collected from 6 demonstration bases showed that a part of the samples were only infected by AYLP or APV1 while another parts were co-infected by AYLP and APV1. Questions that the difficulty in the detection caused the even distribution and low title of the pathogen AYLP and that the easy-to-cofused symptoms for the diagnosis in field in the research of YLD were probed and characteristic yellow symptoms caused by 9 types of factors including YLD and ALYVD， leaf-spot-type diseases， root-rot-type diseases， bud rot， coconut leaf beetle， drought & chilling stress， herbicide phytotoxicity etc were summarized. Problems in the control practices and the pressing situations confronted in the management currently were then analyzed， and key points from tactical and detailed methodical perspectives in the plain paper for the management of areca palm ‘leaf yellowing related diseases were elaborated and its aspects to be further improved together certain problems in the management were pointed out. At the end， foresight of the integrated control measures for the two key leaf yellowing related diseases， which were urgent to implement， were prospected. The aim of this review is to make the latest progress regarding ‘YLD known to researchers and agricultural technicians.DA667E26-CCFB-4AE7-805F-E2D72A702372
Keywords： yellow leaf disease of areca palm （YLD）; areca palm yellow leaf phytolasma;Areca palm velarivirus 1; areca palm leaf yellowing virus disease （ALYVD）; plain paper for disease management
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.016
槟榔（Areca catechuL.）是海南省农业生产中重要的“三棵树”（橡胶、槟榔、椰子）经济作物之一，是种植面积仅次于天然橡胶的第二大经济作物[1]。近年来，随着消费人群持续扩大和价格不断攀升，海南槟榔种植面积及产值逐年增加。根据海南省统计年鉴，2018年底全省槟榔种植面积超过10.99万hm2，产值达到404.9亿元;2020年产值达到543.0亿元，是2010年产值（69.9亿元）的7.77倍。目前，槟榔已成为230多万农民的主要经济来源之一[2]，在全省农业和农村发展、广大农民增收致富中具有重要的地位。
1981年，海南省屯昌县首次发现槟榔黄化病[3]（yellow leaf disease of areca palm， YLD）。此前，国内已有学者[4]根据大田流行规律、电镜、抗生素检测得出中国的YLD病原为植原体的结论，后续的分子检测[5-6]也支持该结论。然而，调查发现除黄化病外，一些生物因素（如炭疽病、椰心叶甲等病虫害）、非生物因素（生理性缺素、气候条件、除草剂等）也可引起槟榔叶片变黄。在陵水、万宁等重病区，已有大面积槟榔园遭受YLD以及其他黄化因子等为害，产量损失严重，重病园几近绝产，造成许多农户丧失种植信心，致使黄化槟榔园失管情况非常突出。许多农户甚至一些农技人员在槟榔黄化病病原或病因认识上产生了较大混淆[2]，把不同原因造成的槟榔黄化均称为“槟榔黄化病”，“槟榔黄化”由此成为一个由多种病虫及生理性因素等伴随发生的复杂问题。因此，再用“槟榔黄化病”来描述生产中的槟榔黄化问题显然不切实际。在此背景下，学界暂用“槟榔黄化现象”的概括性说法，旨在留待后续研究者对各种因子引起的黄化症状进行澄清和区分。近10年来，YLD以及其他黄化相关病害日趋严重[7-9]，已对海南农业经济发展造成严重威胁，引起了各级政府部门、广大槟榔种植户以及相关企业的普遍关注。为了加快YLD及相关病害的基础与防控技术研究，海南省科学技术厅设立了“2018年海南省槟榔病虫害重大科技计划项目”（No. ZDKJ201817，简称“海南省重大项目”），以支持相关科研团队进行重点攻关。近年来，笔者项目团队在槟榔黄化相关病害、病原及检测技术等基础研究上取得了突破性进展。例如，研究发现除槟榔黄化植原体（areca palm yellow leaf phytoplasma， AYLP）外，槟榔隐症病毒1[10]（Areca palm velarivirus 1， APV1）也是引起生产上槟榔大面积黄化的一种病原，其所致病害现命名为槟榔黄叶病毒病（Areca palm leaf yellowing virusdisease， ALYVD）[11]。同时，还发现了2种新的病毒病害，即槟榔坏死梭斑病毒病（Areca palm necrotic spindle-spot virus， ANSSV）[12]和槟榔坏死环斑病毒病（Areca palm necrotic ringspot virus， ANRSV）[13]。目前，对YLD和这3种病毒病害的病原检测技术等方面取得了丰硕进展。新病害ALYVD的发现以及YLD的研究基础依然薄弱的现状给当前和今后的研究提出了新的课题，促使笔者对这2种病害的症状及流行规律等进行进一步深入研究。在生产上，鉴于YLD和ALYVD日趋严重而缺乏一套系统的防控措施的现状，笔者项目团队于2020年7—9月撰写了《槟榔黄化病防控明白纸》，并在万宁市召开了“《槟榔黄化病防控明白纸》研讨推介会”（以下简称为《明白纸》。召开该推介会时由APV1引起的槟榔黄叶病毒病尚称为槟榔黄化病或病毒性槟榔黄化病），这标志着国内“槟榔黄化病”在防控策略和方法上已上升到一个新阶段。然而，迄今尚无评论性文章对《明白纸》进行解读。为此，对上述问题进行分析总结进而明确今后的攻关重点，以加快推进《明白纸》的宣贯，促进YLD和ALYVD这2种致黄关键病害的基础研究与科学防控。
本文通过介绍YLD和ALYVD 2种致黄关键病害及其病原、病原检测技术上的最新进展，分析由于发现ALYVD而延伸的新问题，探讨新的攻关重点;梳理“槟榔黄化现象”各因子引起的黄化症状特点;解读《明白纸》，并分析其有待进一步补充、完善之处，对今后5～10 a在YLD和ALYVD 2种致黄关键病害攻关中有望获得突破的检测及防控技术进行展望。
1 槟榔黄化病及相关病毒病研究进展
1.1 檳榔黄化病
槟榔黄化病（yellow leaf disease of areca palm， YLD）于1914年在印度喀拉拉邦（Kerala）部分地区首次发现[14]。关于印度YLD的病原或病因探索史，国内学者（如车海彦等[9]、朱辉等[15]）已做了相关综述，本文重点介绍槟榔黄化病原及检测技术上的研究进展。1971年，NAYAR[16]从病叶组织上培养获得一种微生物，电镜观察后发现这是一种类菌原体MLO（即植原体）[17]，由此最早提出植原体与黄化病相关。随后的常规技术（包括电镜观察[17-18]、狄纳氏染色[19]）、菟丝子[20]、媒介昆虫甘蔗斑袖蜡蝉（Proutista moesta）接种[20]、血清学[18]和分子检测技术[包括巢式PCR[21-22]、实时荧光PCR（Real-time PCR）[22]、环介导等温扩增（loop- ediated isothermal amplification， LAMP）[23]]均证实印度槟榔黄化病病原为植原体。迄今，已发现印度槟榔黄化植原体具有组或亚组水平上的多样性[24]，存在16SrⅪ-B亚组[21-22， 25]、16SrⅠ-B组[26]和16SrⅪⅤ组[27]3个组或亚组的植原体。由于植原体难以人工培养，无法完成经典的柯赫氏法则。因此，菟丝子、甘蔗斑袖蜡蝉接种实验为印度槟榔黄化植原体的病原性质提供了充分证据。同时，槟榔体内植原体含量低的特点制约了印度槟榔黄化植原体的检出，即便用LAMP技术检测，40份病株DNA样品中仅30份检测呈阳性[23]。DA667E26-CCFB-4AE7-805F-E2D72A702372
在中国，YLD（早期称为槟榔黄叶病）最早于1981年在海南省屯昌县发现[3]，刚开始认为是一种土壤缺钾引起的生理性病害[1]，但采取追施钾肥措施后黄化症状并未得到减轻，病害仍继续发展[3]，这表明YLD并不是一种生理性病害。1995年，金开璇等[3]开展了电镜观察试验，结果发现病株中存在类菌原体和类细菌，由此提出中国槟榔黄化病为类细菌（引起束顶型症状）和类菌原体（引起黄化型症状）复合侵染引起。随后，罗大全等[4]先后进行了2次电镜观察实验，发现黄化型和束顶型2种症状类型的病株叶脉和花苞组织样品韧皮部筛管细胞均存在植原体，但未观察到其他病原物。同时，罗大全等[4]发现四环素注射可抑制染病槟榔病情，由此提出植原体是引起海南省黄化病的一种病原。随后，罗大全等[5]通过巢式PCR从病样DNA成功扩增到植原体特异条带（束顶型样品未检测到，但电镜实验中观察到植原体），实验证明黄化型的槟榔黄化病由植原体引起，但并未明确束顶型槟榔黄化病病原问题。车海彦等[6]、周亚奎等[28]根据巢式PCR产物测序和比对结果分别将扩增得到的AYLP划分为16SrI-G亚组和16SrI-B亚组。于少帅等[29]则将保亭、屯昌、万宁等市（县）扩增到的AYLP划分为16SrI组。同时，还发现各株系与海南苦棟丛枝、长春花绿变、马松子变叶、辣椒黄化皱缩、蛇婆子丛枝、细圆藤丛枝等植原体同源性为100%。该结果表明YLD可能通过这些寄主植物进行传播扩散。车海彦[30]以16S rDNA序列开发了Real-time PCR检测方法，结果显示该方法与传统巢式PCR方法的检测灵敏度相同。随后用该方法对表现黄化症状的30株病株的未展开花苞、心叶以及第2、3、5片叶叶脉总DNA样品进行了检测，检出率分别为100.0%、80.0%、26.7%、46.7%、60.0%，根及病株果实育出的幼苗样品DNA中均未检测到植原体信号。不同部位植原体检测率不同，这表明槟榔黄化植原体在槟榔体内具有不均匀分布的特点。此外，车海彦等[31]于2019年2月至2020年1月对琼海市嘉积镇和万宁市龙滚镇2个染病槟榔园叶片内的病原植原体进行了连续监测和病原检测，发现病叶中AYLP的检出率总体随着温度升高而增加，反之减少。该结果表明病株叶片内AYLP含量具有一定的周年消长规律性：在一定的温度范围内，叶片中的AYLP含量与温度成正相关（例如月平均温度最低的12月，2个槟榔园的监测植株叶片的AYLP检出率均为0，而月平均温度最低的6月，2个槟榔园的AYLP检出率均为80%）。孟秀利等[32]根据16S rDNA序列设计了巢式PCR引物组和F4/R1-F2/R2并建立新的巢式PCR检测方法，发现该组合检测效果优于植原体检测常用的引物组合R16mF2/R16mR1-R16F2n/R16R2。故笔者团队近年来主要应用该方法进行疑似槟榔黄化病样品的检测。在实现槟榔黄化植原体稳定检测的基础上，笔者团队还进一步研发了灵敏、高效的LAMP[33]和微滴式数字PCR（droplet digital PCR， ddPCR）[34]检测方法，二者分别是基于16S rRNA基因和tuf基因序列开发完成。实验结果显示LAMP检测极限为200 ag/μL（即目标片段浓度为53个拷贝/μL）[33]。ddPCR的检测极限为0.07个拷贝/μL，约是LAMP检测技术灵敏度的1000倍[34]。這2种高灵敏度检测技术有望应用于YLD的早期诊断和种苗检测等。
1.2 槟榔黄叶病毒病
近年来，笔者项目团队在病原检测、监测技术等方面均取得了可喜进展，其中一个重要发现是鉴定了另外一种槟榔黄化相关病害——槟榔黄叶病毒病（ALYVD）。2015年，中国科技大学YU等[35]用2012年采集于海南的黄化槟榔样品进行了小RNA测序，发现了一种侵染槟榔的新病毒，命名为槟榔隐症病毒1（Areca palm velarivirus 1， APV1）。该研究为槟榔黄叶病毒病的发现奠定了基础。2020年，海南大学WANG等[10]对采集的来自槟榔黄化病流行区以及非流行区的样品进行了检测，结果来自流行区（保亭等8个市、县）有黄化症状的样品均检测到APV1（检出率100%），来自流行区琼海和万宁的部分无黄化症状样品也检测到APV1（检出率分别为50%和21%），而来自非流行区儋州和海口的样品均未检测到APV1（0%）。该结果表明APV1与海南“槟榔黄化病”高度相关。最近，该团队通过双条拂粉蚧（Ferrisia virgata）接种试验成功完成了APV1病原性质验证。用带毒双条拂粉蚧接种槟榔幼苗30 d后检测到APV1，60 d后幼苗逐渐开始表现与田间“槟榔黄化病”类似的不均匀黄化症状特征（叶肉褪绿变黄而叶脉保持绿色），75 d后检测呈阳性幼苗数量达到峰值，不再增加[36]。CAO等[37]对新测序的20个APV1株系的全基因组序列进行了比对分析，结果发现APV1基因组存在3'端序列高度保守（核苷酸序列同源性>95%）的7个开放阅读框和5'端则具有序列多样性（核苷酸序列同源性为81%～87%）的3个开放阅读框。系统发育分析结果表明20个APV1株系可分为3个遗传谱系，其中16个株系聚类于谱系A，这表明谱系A是海南槟榔上最具流行性的APV1基因型。同时，研究发现3个谱系中均存在不同基因型混合感染的情况，这与APV1基因组具有较高水平的遗传重组密切相关，这表明不同基因型混合感染可引起APV1基因组的重组。目前针对APV1开发了反转录-PCR（RT-PCR）[10]和酶联免疫检测方法[38]。双条拂粉蚧接种试验结果表明APV1也是引起槟榔黄化的一种病原。由APV1引起的病害最初称为“槟榔黄化病”[10]，现从槟榔黄化病中分离出来，命名为槟榔黄叶病毒病（ALYVD），从而区分此前已经存在的、已纳入农业行业标准[39]的由槟榔黄化植原体引起的槟榔黄化病。2020年前，学界一直认为槟榔黄化植原体是导致海南槟榔大面积黄化的“元凶”（尽管也有一些质疑，但并未证实还有其他病原），APV1与槟榔黄叶病毒病的发现则打破了这种认知局限，促使笔者项目团队从更新、更全面的角度重新审视海南“槟榔黄化病”并开展病害防控等相关研究。DA667E26-CCFB-4AE7-805F-E2D72A702372
为了更好地推进示范基地的病害防控工作，笔者项目团队对6个基地的黄化植株进行了病原检测。检测结果显示（表1，尚未发表），所有基地均检出AYLP和APV1 2种病原，表明6个基地均存在AYLP和APV1感染;而且6个基地的部分植株黄化是由AYLP或APV1单独感染引起，部分植株是由AYLP和APV1复合感染引起。
1.3 槟榔坏死环斑病毒病和槟榔坏死梭斑病毒病
除了槟榔黄叶病毒病外，YAND等[12-13]发现
了另外2种新的病毒病害——槟榔坏死梭斑病毒病和槟榔坏死环斑病毒病，并在病原检测技术和致病机理研究方面取得了突破性进展。槟榔坏死梭斑病毒病于2017年10月在保亭县首次发现，且仅在保亭有发现。槟榔坏死环斑病毒病于2019年首次报道，定安、琼海、琼中、万宁、保亭、陵水、临高、屯昌、琼中、文昌均有发生，其中，万宁、定安和琼海局部区域分布较广，发病率分别达46%、45%和36%[13]。这2种病害的病原分别为ANRSV[12]和ANSSV[13]。目前，针对ANRSV和ANSSV已研发了3种高效、灵敏的核酸检测方法，包括反转录-PCR（RT-PCR）、反转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）[40]和反转录重组酶聚合酶-侧流层析试纸条（RT-RPA-LFD）检测方法[41]。同时，孙迪[41]根据病毒外壳蛋白特异抗原决定簇制备了多克隆抗体，以此建立了血清学检测方法。最近，该团队在前导蛋白酶功能上取得了原创性进展，在国际上得到了较大关注。QIN等[42]通过基因组注释和序列分析表明ANSSV和ANRSV在分类上归属于马铃薯Y病毒科的一个新属——槟榔病毒属（Arepavinus）。不同于该科其他病毒，ANSSV和ANRSV编码特异的前导蛋白酶为一个串联的半胱氨酸蛋白酶（HCPro1-HCPro2）。通过构建酶切位点突变载体和体外翻译等实验，发现ANSSV编码的HCPro1和HCPro2的切割位点分别是273G/S274和574G/G575。进一步的基因沉默抑制子实验表明，与其他Potyviral HCPro不同，HCPro2是病毒沉默抑制子，其抑制基因沉默活性独立于上游蛋白酶HCPro1的酶切事件。该研究为进一步深入研究病毒致病新机制奠定了基础。
1.4 中国槟榔黄化病研究中存在的问题及黄化因子特征分析
目前，一直制约国内槟榔黄化病研究的2个关键问题是：（1）槟榔黄化植原体具有分布不均的特点[30]，而且含量很低[2， 23]，给病原检测、致病机理等研究带来了挑战。研究发现用传统的巢式PCR方法进行检测时植原体检出率较低。例如周亚奎等[28]在万宁、琼海、陵水采集了28株病株的叶片样品，仅来自万宁和琼海的9份样品检测到植原体。曹学仁等[43]在采集的49个黄化样品中仅15个样品检测到植原体。笔者团队改进后的巢式PCR方法的检测极限也仅为25 ng/μL（样品总DNA浓度，尚未发表）。因此，若无YLD病原检测经验或植原体研究背景的研究人员的协助与指导，在进行槟榔黄化植原体检测时则经常会遇到例如样品采集、巢式PCR污染等各种问题，造成检测试验失败。（2）不同因子造成的“真假”槟榔黄化病并存情况较多，给YLD（包括新病害ALYVD）的病原认识和诊断带来了极大困扰。在省重大项目立项之前，调查发现除YLD外，一些生物因素（如炭疽病、细菌性叶斑病[44]等叶斑类病害，褐根病、红根病[45]等根部病害，以及害虫椰心叶甲[2， 7]）均可引起槟榔叶片变黄。此外，非生物因素如除草剂[43， 46]、气候（干旱、寒害）、生理性缺素[45]等也会导致槟榔叶片变黄。在陵水、万宁、琼海等病区，通常是YLD与1种或多种病虫害同时发生，且多种病害引起的病斑症状非常相似、发病初期难以区分。加上营养和气候等因素干扰，田间YLD与“假槟榔黄化病”并存情况较多，很容易造成混淆。许多农户因缺乏相关的植保知识，将生产上各种因子引起的槟榔黄化均称为“槟榔黄化病”或“槟榔黄叶病”（也有农户将其称为“叶瘟”）。同时，学界对YLD的病原或病因是否仅有植原体这个问题也有较大分歧。在此背景下，为了回应YLD病原认识上的分歧以及实际生产中多种致黄因子存在的问题，学界暂时采用“槟榔黄化现象”（槟榔在生长过程中所表现出的叶片变黄的表征或症状）的概括性概念，以待后续研究进行澄清，进而查明YLD的本质（病原或病因）。对YLD进行精准诊断和识别正是省重大项目中需要完成的一个重要任务。
经过近年来的调查研究，生物和非生物因素中各种因子的致黄特点现已基本明确。（1）YLD和ALYVD是2种致黄关键病害。这是导致生产上槟榔大面积黄化、树势衰弱、减产的2种致黄关键病害，目前尚无有效的防治药剂，只能采取综合措施进行防控。其田间症状特点比较类似（尽管目前作了症状初步区分，但还需进一步补充完善），表现为发病初期树冠倒数第2、3片羽状复叶的部分小叶首先黄化，随后黄化症状向上层叶片扩展，发病中后期树冠缩小呈束顶状，严重者植株死亡。这2种病害有发病中心。（2）叶斑类病害。包括炭疽病、细菌性叶斑病[44]以及新报道的坏死梭斑病毒病[12]和坏死环斑病毒病[13]等，其症状特点为在叶片局部产生带黄色晕圈的病斑，严重者叶片上病斑累累。炭疽病仅在琼中等局部区域发病较重，细菌性叶斑病多在台风季节爆发，病害严重时虽可导致叶片枯死，但防治较容易。坏死梭斑病毒病目前仅在保亭有发现，坏死环斑病毒则在定安、琼海、万宁等市（县）均有发生。YLD和ALYVD 2种病毒病的传播途径、防控方法及其对产量的影响等研究尚待开展。（3）根腐病害。包括褐根病、红根病、黑纹根病[45]。其症状特点为发病后植株下层老叶首先变黄、下垂，严重者植株死亡。3种根病地上部分的黄化表现在下层叶片，容易与YLD和ALYVD进行区分。此外，根腐病从表现症状到植株死亡通常仅需几周至几个月，而YLD从表现症状到死亡常长达5～7 a[7]（ALYVD有待进一步研究）。根腐病多是单个而非连片槟榔园发生，一旦发病常引起植株死亡，防治存在一定难度。（4）芽腐病。该病表现为感染后心叶首先变黄，常造成植株死亡。芽腐病在琼中县有发生，但多为零星发生。（5）藻斑病。常造成下层叶片衰弱，叶柄、叶片、叶鞘上均长出带有黄色晕圈的麻点状小病斑，病斑上常可见黄褐色毛毡状物，易与其他叶斑病区分。该病为害较小。（6）椰心叶甲。该虫在陵水、万宁、琼海等市（县）发生严重，可以引起整园甚至局部区域槟榔园连片枯黄，其为害甚至超过YLD和ALYVD。椰心叶甲主要危害心叶，造成树冠缩小，心叶甚至植株死亡，对产量影响较大，可通过喷施高效氯氰菊酯、辛硫磷等药剂或释放天敌寄生蜂（椰甲截脉姬小峰和椰心叶甲啮小峰）进行有效防治。（7）干旱和寒害。干旱可季节性地引起局部或大范围槟榔园叶片因缺水而失绿变黄，多表现在下层叶片。干旱对于新定植的1～2 a的幼树甚至成龄树影响较大，若不及时灌水，达到一定极限后下部1～2片叶常在一周至几周内快速干枯、死亡。干旱造成的黄叶症状可通过灌水措施得到缓解、恢复，无灌溉条件时到雨季也可逐渐恢复健康绿色状态。海南每年5—8月为高温干旱季节，干旱通常是对全岛范围内的槟榔均有影响，不具发病中心的特点。寒害多发生于1月或12月，持续数天低温（通常是低于10℃）天气会引發寒害。2021年1月海南遭遇低温（1月13日琼中县黎母山镇监测到-0.3℃低温），全岛西至澄迈、南到三亚的槟榔均有寒害发生。初期症状表现为叶片出现褪绿、干枯病斑，此后叶片呈淡绿至浅黄色。调查发现万宁、琼海、定安等地大面积槟榔受寒害影响叶片变黄情况较普遍，至4月初才逐渐恢复。台风也有一定影响，除了对槟榔叶片直接伤害外，还表现在引起槟榔细菌性叶斑病的爆发以及造成椰心叶甲大面积扩散。此外，水害沤根也会引起叶片变黄，多见于地势低洼、排水不良的槟榔园。（8）生理性缺素及肥害。生理性黄化多见于管理不善或失管槟榔园，表现为全园植株树势衰弱，全株叶片因营养不良表现为浅绿色，略带黄色。调查发现，刚定植1～2 a幼树有时也会出现生理性黄化的情况。肥害多发生于集中过量施用硝酸钾、硫酸钾、氯化钾等化学肥料或未腐熟的牛粪、羊粪、猪粪等有机肥[45]，导致烧根从而引起下层叶尖、叶缘失绿变黄，叶尖多变褐枯死。生理性缺素或肥害引起的黄化无发病中心。杨旭光等[47]研究表明槟榔园水肥供施情况和土壤中养分状况与槟榔黄化病的发生无必然联系。（9）除草剂药害。除草剂问题是在2013年前后才引起注意和重视的。笔者调查发现生产上常用草甘膦等灭生性除草剂，造成地表根系变褐坏死，叶片褪绿变黄、枯死，最后整株枯死。吴童童等[46]发现在生产中除草剂使用非常普遍，且除草剂使用历史越长、频率越高时，园中槟榔长势越差。除草剂虽与槟榔园黄化有一定相关性，但其引起的黄化不具备发病中心的特点。综上，生产上引起槟榔黄化的因素尽管较多，且多个因子常同时并存于黄化槟榔园，通过综合考虑田间症状、病虫害发生历史、种苗来源、水肥管理及除草剂施用等情况，通常可以区分YLD（和/或ALYVD）与其他因素引起的黄化。YLD与ALYVD则需综合考虑田间症状并结合分子检测结果进行区分。DA667E26-CCFB-4AE7-805F-E2D72A702372
迄今，已基本理清YLD和ALYVD与其他8类因子的“黄化”症状，笔者认为对各种因子引起的“槟榔黄化现象”进行澄清，解析槟榔黄化病本质的时机已日趋成熟。鉴于YLD和ALYVD分布广泛、造成的损失严重、防控难度大、社会关注程度高，建议今后将这2种致黄关键病害作为核心对象进行重点防控。
1.5新的科学问题及今后的攻关重点
新病害ALYVD的发现拓宽了对老病害YLD的认识，也提出了新的科学问题：（1）YLD和ALYVD的症状区别表现在哪些方面？（2）YLD和ALYVD病害的流行规律如何？（3）YLD和ALYVD病害是如何传播的？（4）YLD和ALYVD病害致黄机理存在哪些异同？
针对槟榔黄化病，现阶段需要聚焦的攻关重点有3个。（1）现有的检测技术各有不足。例如改进的巢式PCR方法灵敏度依然偏低且费时费力;虽然LAMP灵敏、快速（约3 h即可获得检测结果）、结果可视化，但技术操作过程中需格外避免污染的问题;ddPCR灵敏度极高但检测仪器昂贵且成本偏高（1个样品3次重复平均检测费用为240～250元;巢式PCR为1.8～2.0元;LAMP为25～100元。美国和日本试剂价格差异较大，笔者注），故LAMP和ddPCR这2种方法并未用于高通量檢测工作。因此，需继续研发其他检测方法，对不同检测方法进行对比和评价，进而筛选出1～2种灵敏、高效的检测方法是亟需攻关的重点。（2）虽然对YLD和ALYVD的症状进行了初步区分，但还需重点对这2种病害症状的扩展情况进行细致观察，进一步明确其症状和流行规律的异同。（3）植原体是一类通过媒介昆虫传播的病原菌[48]，一旦确认YLD的媒介昆虫并研发相应防治技术可为槟榔黄化病的防控提供有力支撑。目前，已在柑橘棘粉蚧等6种刺吸式口器昆虫体内检测到AYLP[49]。因此，加快疑似媒介昆虫接种验证、传毒特征研究，并开展防治技术研究也是当前的攻关重点。
2 槟榔黄化病和槟榔黄叶病毒病的防控
迄今，槟榔黄化病和槟榔黄叶病毒病2种病害流行规律、监测以及防控方面的进展更多地来自前者（如病害监测和防控实践[50]）。然而，受广大农户对槟榔黄化病认知、槟榔价格持续处于高位等方面的影响，此前一些学者提出的YLD防控措施（如砍除病株）在实际生产中实施的并不多，全省仅有三亚市组织实施了砍除病株的措施[51]。同时，ALYVD的发现也大大增加了防控难度。因此，有必要重新梳理YLD和ALYVD 2种致黄关键病害的基础资料并制定针对性的防控策略和措施。
2.1 防控形势紧迫
从1995年金开璇等[3]最早提出植原体（即类菌原体MLO）与黄化型YLD有关开始，20多年以来YLD（包括ALYVD）并未得到有效控制，甚至不断蔓延危害，发生范围、面积逐步扩大，病情日趋严重。海南全省（不含三沙市）调查结果表明，由AYLP和APV1引起的槟榔黄化面积为4.00～5.33万hm2（尚未发表），若任由其继续扩散蔓延，将会给海南经济、社会及生态带来难以估量的损失。与此同时，生产上还缺乏一套公认的、能够科学指导防控槟榔黄化病和槟榔黄叶毒病的指南。鉴于此，笔者团队结合近年来的科研成果编写了《槟榔“黄化病”防控明白纸》（此处槟榔“黄化病”指黄化病和黄叶病毒病，下同。为了便于广大槟榔种植户的理解和接受，《明白纸》未对YLD和ALYVD进行区分）。《明白纸》充分借鉴了柑橘黄龙病[52]、椰子致死性黄化病[48， 53]、枣疯病[54-55]、葡萄金黄化病[46]等类似病害的防控措施（表2），根据植保领域专家学者、一线农技人员提出的建议进行完善，于2020年9月在万宁市正式向各市（县）农技人员和广大槟榔种植户推介，得到了广泛关注。
2.2 《明白纸》解读
《明白纸》提纲挈领地介绍了槟榔“黄化病”病原、症状、危害等级、传播途径，确
立了“预防为主、分类防控”的策略，并提出了综合防控措施。《明白纸》的制订与推介实施是槟榔黄化病和黄叶病毒病研究和防控中的一个里程碑，以下作简要解读。
2.2.1 危害等级标准 槟榔园危害等级标准：轻病园，全园发病率20%以下;中病园，全园发病率20%～50%;重病园，全园发病率50%～70%;特重病园，全园发病率70%以上。这是分类防控策略的依据。
2.2.2 传播途径 传播途径主要是种苗和媒介昆虫，这是种植健康种苗、防治介体昆虫的依据。
2.2.3 槟榔园黄化病3个关键预防措施 （1）选用无病种苗，严禁从疫区引进种果和种苗;严禁用感病槟榔园的种果进行育苗;严禁在感病槟榔园及周边育苗。（2）槟榔园禁用草甘膦除草剂。（3）不在病园内新种幼苗。
2.2.4 槟榔园黄化病分类防控措施 （1）针对新建槟榔园，从种苗开始进行预防，种植无病种苗，隔离种植，远离感病槟榔园，建议间隔至少1 km以上，避免连片种植。（2）针对健康园，以预防为主。加强肥水管理;全面除杀刺吸式口器害虫，预防病害传播入园;一旦确认园内有植株感染植原体或APV1，做到发现一株清除一株。（3）针对轻、中和重病槟榔园，控治并举，采用“五板斧”措施。即，“一养”：加强肥水管理，养根养树，提高槟榔树体营养，增强树势。“二诱”：诱抗，结合除杀刺吸式口器害虫，叶面喷施免疫诱抗剂、叶面肥，诱导槟榔产生抗性和提高免疫力。“三调”：生态调控，通过丰富林间生物多样性，改善林下微生态环境，达到涵养水源、以草（或其他作物）控草甚至增加收入的目的。“四治”：综合治理，结合免疫诱抗处理对病原及传播媒介采用化学、物理等防控技术，降低菌源、阻止传播。“五除”：加强病害管理，清除病叶和病株，减少传染源。（4）针对特重病园，全园更新。清除全园后，种植其他短期经济作物，至少2 a后再重新种植健康槟榔。DA667E26-CCFB-4AE7-805F-E2D72A702372
《明白纸》充分考虑了以下4个因素：（1）槟榔是一种常绿棕榈植物，经济寿命可长达30 a;（2）现有的种植管理模式（单一、“懒人”模式）;（3）种植4～5 a后才开始结果，在此期间农户通常一直无收获回报;（4）染病2～3 a内，整园产量通常不会大幅下降，水肥管理好的槟榔园产量会保持一个较高的水平;（5）近年来鲜果价格较高，绝大部分农户尚不愿接受砍除病株的措施，主动砍除病株的农户仅是极少数。整体而言，对于中、重度发病槟榔园采取的是一种带病维持生产的策略。然而，从整个槟榔产业的长远发展来看，病园更新的措施必不可少（参考柑橘黄龙病园更新措施[7]），否则2种病害仍将持续扩展，危害继续加重。虽然YLD和ALYVD尚无特效防控药剂，但通过上述综合防控措施可在一定程度上达到控制病害蔓延、延长槟榔植株经济寿命、提高或维持产量的目的。
2.3 《明白纸》需进一步完善之处及防控中亟待解决的问题
目前，海南全省的YLD和ALYVD防控形势仍非常紧迫。及时发布《明白纸》为这2种病害的科学防控提供了指南。然而，目前对这2种病害的了解依然不够深入，《明白纸》中病害基础介绍及防控措施的部分内容还需进一步完善。如，媒介昆虫研究尚显不足。虽然已发现柑橘棘粉蚧、双条拂粉蚧可以传播APV1[36]，YLD带“毒”昆虫方面也有阶段性进展[11]，然而这些昆虫的交配产卵、种群动态等生物生态学特性、传毒特征以及防治技术等研究尚待开展。这些研究结果将进一步有针对性地补充和完善《明白纸》的基础知识以及防控目标、防控技术和方法等。
槟榔黄化病和槟榔黄叶病毒病防控中还面临很多问题，但最根本或亟需解决的问题有3个：（1）转变主管部门对YLD及ALYVD的防控认识与指导思想。只有充分认识到现有的种植模式及技术措施无法完全根治YLD及ALYVD的事实，才能转变“治疗”“治愈”观念，形成YLD及ALYVD可防可控不可治的统一认识[56]，从而牢固树立“预防为主，分类防控”的战略指导原则，依照《明白纸》中的措施系统推进防控工作。（2）转变广大农户长期以来的槟榔“懒人种植”模式（管理意识淡薄，重种植、轻管理，管理投入不足或几乎不投入）以及对病害的认知。只有彻底摒除侥幸心理，改变先前“靠天吃饭”的种植模式，加强水、肥、草管理和病虫害防控，及时清除病株残体，才能形成有利于槟榔健康生长、YLD及ALYVD防控的条件。（3）建立种子种苗检疫制度和健康种苗保障体系。近年来海南槟榔种苗市场非常活跃，万宁等疫区一些农户留老果育苗的情况较多，多个种苗公司年育苗量达到几万甚至几十万株。调查发现大多未做隔离或预防措施，这些来自疫区的种苗具有较大的带“毒”风险，笔者的采样检测结果也证实了这一点[11]。因此，建议加快槟榔种果种苗检疫制度及健康种苗繁育体系建设，禁止疫区农户和种苗公司育苗售卖，非疫区的种苗也需具有检测资质的单位现场抽样、检测，获得健康种苗报告后方可销售。
3 展望
近年来，海南省重大项目团队在YLD及ALYVD研究上取得阶段性进展。在槟榔黄化相关病害方面，明确了2种致黄关键病害——YLD和ALYVD，并区分了这2种病害与其他8类因子的黄化症状，对“槟榔黄化现象”说法进行了澄清。在病原检测方面，针对YLD和ALYVD研发了可供病害早期诊断的灵敏、高效、快速的检测新方法，后续有望开发出可用于田间检测的方法和产品。在传播途径和防控方面，笔者发现来自万宁等疫区的部分种苗有AYLP和/或APV1感染（尚未发表），为种苗检疫措施的实施提供了依据。同时，在万宁、定安2个病园遗留的槟榔老果组织DNA样品中检测到AYLP[32]，若证实带“毒”种果育出的种苗同样带有AYLP和/或APV1，則将进一步研究种苗脱毒或组培脱毒，为健康种苗供应、病害防控提供保障。此外，YLD带“毒”昆虫[11]及ALYVD媒介昆虫[36]方面的研究也有一定进展，后续研发的防治技术将进一步提高这2种病害传播媒介的防治效果。总之，预期5～10 a内在YLD及ALYVD病原检测、种苗脱毒、媒介昆虫防治方面有望获得突破，《明白纸》的不断完善也将进一步发挥对YLD及ALYVD防控的指导作用。
近10 a来，槟榔致黄关键病害YLD及ALYVD危害逐年加重，发病面积不断扩大，现已给海南槟榔产业的健康发展和农民增收带来了严峻考验，其科研攻关和有效防控需要从“产学研推用”多个层面协调进行[57]，通过政府指导与专项资金支持（科研资助、重病园更新及带毒种苗销毁补偿等）、科研机构重点攻关、企业技术推广、农户依据《明白纸》的措施积极加强管理和病虫害防控，YLD及ALYVD引发的槟榔黄化问题将得到有效控制，以保障槟榔产业的可持续健康发展。
致谢 感谢海南大学黄惜教授团队在示范基地病样APV1检测工作中的帮助与支持。
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