青蛤贝壳与内部组织间连接观察*

王亦我，仉佳文，刘 玉，魏 敏，张明月，吴雨晨，仇 攀，宋 杰，郑 伟，董志国

(江苏海洋大学 a.江苏省海洋生物技术重点实验室；b.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心,江苏 连云港 222005)

0 引言

青蛤(Cyclinasinensis)，属软体动物门、双壳纲(Bivalvia)、帘蛤目(Veneroida)、帘蛤科(Veneridae)、青蛤属(Cyclina)[1]，俗称黑蛤、圆蛤、牛眼蛤等，广泛分布于日本及我国南北沿海砂质的潮间带，是常见的埋栖型暖水性双壳贝类[2]。随着我国水产养殖业的不断发展，对贝类的研究也越发深入。青蛤因具有完整的基因组图谱[3]、清晰的遗传背景、直观的表型性状等特点，再加上繁殖快、易培养、后代数目多等优点,展现了其成为双壳贝类代表种的潜力[4-5]。现在有关青蛤的研究大多集中在生长营养、生物学特性、生理生化和苗种培育等方面[6-11]，而对形态学的研究深度不足，且有的因年代过于久远，造成图片失真难以辨认[12]。为了方便后续深入研究，深挖青蛤作为双壳贝类代表种的参考价值，本研究通过对青蛤外部形态和内部组织结构的观察，获得大量高清图片，系统性地梳理青蛤组织间关系，并重点观察青蛤组织与贝壳的具体连接方式，以期为双壳贝类形态及解剖学研究提供和补充可靠资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物为2龄左右青蛤，采集自山东潍坊地区。在实验室内恒温循环水暂养3周，取其中40只体型完整、规格相近、活力良好的个体进行外部形态学观察和内部解剖学分析。

1.2 外部形态观察

将挑选出的个体置于装满澄清海水的水生动物实验用养殖单元中，观察其在适宜环境中的生存状态，包括外套膜、斧足、鳃和水管在呼吸摄食过程中充分延展状态下的形态特征。之后对其进行活体解剖。把青蛤水平放置于在解剖盘中，用解剖刀从青蛤铰合处后部的韧带切入，沿壳缝方向依次切断后闭壳肌和前闭壳肌，打开贝壳清除内部残留的泥沙，便于后续实验观察。

1.3 内部组织连接观察

观察从活体样品分离出的完整软体部，用贝类生理盐水[13]处理后固定在体积分数10%的甲醛溶液中，使用放大镜、Nikon SME 1500体视显微镜对其不同组织的连接处进行观察。软体部整体观察完成后，对外套膜、鳃、斧足及内脏团等主要组织进行组织间连接观察。

2 结果

2.1 外部形态观察

青蛤贝壳左右两壳对称相等且近似圆形，外表呈白色、黑色，部分青蛤带有面积较大的紫色条纹，被认为是紫壳青蛤(见图1)。壳内面大体呈白色，外表面带有紫色条纹的部位壳内面呈现紫色(见图 2)。壳面突出，表面附有生长线，近于顶端部分细密，至腹缘渐次变粗且突出壳面。壳顶位于贝壳背部接近中间的位置，壳顶有尖端且尖端向前向内弯曲，较其他双壳贝类而言青蛤外壳没有小月面，楯面狭长。左右两贝壳通过铰合部中的韧带及铰合齿相互作用相连(见图3)。

图1 白/紫壳青蛤的外壳颜色(左：白壳；右：紫壳)

图2 白/紫壳青蛤的壳内面颜色(左：白壳；右：紫壳)

a—铰合齿；b—韧带。

据观察,青蛤铰合齿与文蛤相近，属于异齿型铰合齿，由位于壳顶之下的主齿和远离壳顶位于壳的前后背缘的侧齿所组成，其中左右壳各有3道主齿及齿槽，呈“爪”状排列(见图4)，相对两齿之间交错互补。韧带位于铰合部的后方，由碳酸钙和蛋白质构成[14]，分为外韧带和内韧带。外韧带位于壳顶后面两壳的背缘；内韧带位于壳顶下方铰合部中央的韧带槽中(见图5)。由于韧带具有一定的弹性，当闭壳肌收缩时韧带被拉伸，闭壳肌放松时贝壳受到韧带的回弹作用被打开。

图4 “爪”型铰合齿(由一道竖齿及两道侧齿组成)

图5 韧带(呈现出均匀的层状结构)

2.2 内部组织连接观察

2.2.1 软体部观察 切开前后闭壳肌后打开青蛤，观察到外套膜及闭壳肌粘附在贝壳上，内脏团位于青蛤基部韧带部上方，由青蛤从闭壳肌伸出两组肌肉与内脏团相连。这两组肌肉被称为足收缩肌(见图6和图7)，专司控制青蛤的运动，例如青蛤斧足挖泥掘沙等。

图6 足收缩肌(可见3条,2条前足收缩肌和1条后足收缩肌)

图7 前后足收缩肌(共有2组4条收缩肌)

从贝壳取出完整的软体部观察(见图8)。软体部是将贝壳去除后，含闭壳肌在内的全部有机组织。软体部最外层的两叶薄膜状组织是外套膜，从软体部背侧向腹侧伸展，紧贴两贝壳内表面与内脏团、鳃和足等组织形成发达的外套腔，其背缘与内脏团背面的上皮组织相连。外套膜边缘为环走肌，即沿着外套膜的边缘而环走的肌肉纤维并用以收缩外套膜边缘[15]。腹缘则是放射肌及结缔组织，颜色透明微黄，因此边缘部分的外套膜较厚，其余部位较薄，其中嵌入两块较大的肌肉组织即为前后闭壳肌(见图9)。外套膜与内脏团背部连接(见图10)，且左右两侧的外套膜与内脏团于同一位置连接在一起；内脏团与鳃在基部连接(见图11)，内脏团两侧各有两片鳃在基部与内脏团相连；鳃介于外套膜与内脏团之间(见图12)。

图8 软体部

a—外缘；b—腹缘；c—前闭壳肌；d—后闭壳肌。

a—外套膜；b—内脏团。

a—内脏团；b—鳃。

a—外套膜；b—鳃。

青蛤外套膜是包括了肛门孔、鳃孔和足孔在内的三孔型外套膜，肛门孔和鳃孔从外套膜上延长异化成水管。在水管基部有外套膜环走肌后部分化而成的水管肌，它的机能是牵引水管。青蛤的水管由进水管(鳃水管)与出水管(肛门水管)构成(见图13)，进水管较出水管长且粗。水管在基部与外套膜形成一个双腔结构(见图14)，青蛤即通过进水管和出水管与外界进行物质交换。

a—进水管；b—出水管。

a—进水管；b—出水管。

软体部的核心是内脏团，包括青蛤的消化系统、排泄系统、循环系统、性腺、神经系统在内，除消化系统呈棕色外，其他部分呈乳白色，斧足下部连接有足收缩肌。

青蛤的足位于内脏团腹面，为黄玉色肌肉质突起，通常侧扁呈斧状，又称为斧足，受足收缩肌控制，是青蛤的主要移动器官(见图15)。

a—斧足；b—足收缩肌根。

青蛤的鳃在内脏团两侧，一共4片鳃瓣，左右各2片，由外套膜的内侧壁延伸而成。两侧内鳃瓣基部与内脏团侧面愈合，起始于外套膜与内脏团后方部位，渐次扩展至前方的唇瓣附近，是青蛤的主要呼吸部位(见图16)。

图16 鳃(可观察到明显纹理，红色箭头所示)

2.2.2 闭壳肌连接观察 青蛤有两块闭壳肌，即后闭壳肌和前闭壳肌(见图17)。前闭壳肌切面呈半月状，位于壳顶偏右位置，细长而窄；后闭壳肌切面呈椭圆形，位于壳左面中间位置。闭壳肌与壳紧密相连，贝壳闭合时闭壳肌为收缩状态，闭壳肌痕即其与壳连接形成的固着点，通过内窥镜观察到闭壳肌存在明显的纹路(见图18)。

a—后闭壳肌；b—前闭壳肌。

图18 收缩状态下的闭壳肌纹路

2.2.3 肌肉—贝壳连接观察 贝壳是一种由外套膜分泌的碳酸钙最终沉积形成具有不同微观结构层次的非细胞组织，而闭壳肌和外套膜均属肌肉组织，两者之间的连接涉及有机物—无机物之间的结合。经观察发现,外套膜边缘虽在壳内面形成外套线(见图19)，但与贝壳的连接并不紧密，使用镊子轻微反复拉扯便可使其脱离，难以固定软体部。经多次尝试后可感知到，外套膜内膜与外套线某些位置存在明显的紧密连接点，放大后在壳内面可看到细微的小凸起(见图20)。凸起围成的区域被称为外套湾(见图21)，由外套线向内凹陷形成，是当水管受到外界刺激缩入壳内时容纳水管之处。

图19 外套线(红色箭头所示)

图20 外套湾(局部放大后可观察到表面凹凸不平，存在突起,红色箭头所示)

图21 外套湾(红色箭头所示)

从体视镜下观察闭壳肌与壳连接处的横切面，发现闭壳肌与贝壳的内面粘附紧密，没有丝毫缝隙(见图22)。

a—闭壳肌；b—壳。

3 讨论

青蛤是我国重要的经济型双壳贝类，主要栖息于近高潮区和中潮区的滩涂中，且多集中于有淡水汇入的河口附近。在青蛤外部形态观察中，发现其存在白、紫、黑3种壳色，其中白色和紫色属于可遗传性状[4]；黑色属于环境影响性状，在泥沙底质中生长的青蛤壳受到氧化作用变成黑色[3]，在无底质新鲜海水中养殖一段时间后，黑色消退显现出白壳或紫壳的底色。两壳间铰合齿的存在保证了青蛤不会由于平行于壳缝方向的剪切力作用导致非自然移动。青蛤内部组织结构中占比最大的是内脏团和外套膜。内脏团包含了心脏、性腺等众多组织，支配着青蛤的生理活动，也是青蛤最重要的核心组织，因此在青蛤中占比重最高。其次就是外套膜，外套膜包围着所有的内脏组织并紧贴在壳上，形成一个密不可分的整体。外套膜还起着保护内部组织结构的作用，当受到外界压力时，外套膜会有一定的缓冲作用，以减少内部组织的损伤。除此之外，外套膜与鳃、水管、闭壳肌等组织也存在着紧密联系。

青蛤的鳃属于真瓣鳃型，其特点是外鳃瓣上行板的游离缘与外套膜内面相愈合，而内鳃瓣上行板前部的游离缘则与背部隆起的侧面相愈合，后部的游离缘通常为身体左右两侧的鳃瓣上行板之间互相愈合[16]。

水管位于青蛤闭壳肌的下方，由外套膜环肌分化形成。外套膜与水管连接处内凹形成一处三角状空腔，此处是为了水管的进出留出空隙，当水管收缩回时，外套膜外缘闭合形成一个封闭的空间，这样的结构有利于隔绝体内外环境，保证青蛤与外界进行相对安全的物质交换。外套膜闭合后内部形成外套腔，外界环境中的藻类、氧气和水由伸出体外的进水管吸入外套腔内，食物通过唇瓣进入口中，通过鳃瓣吸收氧气后与肛门排出的粪便一起再经由出水管排出体外。

闭壳肌从表面上看是独立于外套膜并与膜内结缔组织直接相连，但有研究证实，闭壳肌是由浮游幼虫阶段的幼虫壳收缩肌在发育过程中演化形成，而外套膜肌肉则在壳收缩肌萎缩之后逐渐生成[17]。剥离表面的肌肉组织后发现，其下方存在两束足收缩肌与内脏团腹面连接在一起，并通过脑侧神经节控制前闭壳肌；脏神经节向水管肌、鳃、后闭壳肌、内脏、外套膜等发出神经，并控制它们活动；足神经节向足部发出多条神经，控制并调节其活动[12]。这些神经关联使得闭壳肌、足收缩肌与内脏团上的足组成了青蛤完整的运动系统。

前、后闭壳肌与壳之间联系紧密，与其他组织的连接方式不同，解剖过程中很难将其分离。软体动物的贝壳基本结构通常分为3层：最外侧的角质层、中间的棱柱层和壳内表面的珍珠层[18]。在双壳贝类中，闭壳肌与贝壳内表面连接的部位被称为闭壳肌痕。组织学分析显示：在闭壳肌痕处的贝壳结构为棱柱层，在贝壳中所占比例较低且往往包埋在贝壳内部。但在肌肉—贝壳连接界面，即闭壳肌痕部位，该层暴露于贝壳内侧表面并直接与后闭壳肌连接[19-21]。这意味着棱柱层在贝壳与肌肉的连接中发挥着重要作用，也必然存在某种分子机制将棱柱层与闭壳肌两种完全不同的物相体系紧密结合在一起。闭壳肌与铰合齿同为控制壳开闭的主要组织，形成这样的连接方式与贝类自身的生活习性息息相关。

闭壳肌的主要生理机能是闭合贝壳。闭壳肌分为横纹肌和平滑肌两部分，横纹肌在闭壳肌中所占比重较大，肌肉呈交叉条纹状态，在贝壳瞬间闭合时发挥主要作用，肌肉质地柔软；平滑肌肌肉呈波浪状，在贝壳闭合后长期维持闭合状态时发挥主要作用，相对于横纹肌肌肉质地较硬[22-23]。闭壳肌为了减少能量消耗，通常长时间保持收缩状态。观察发现，后闭壳肌比前闭壳肌生长空间更大，但组织结构并不是很紧密，且位于韧带下方，理论上来讲可以承担更多的生理活动。

4 结论

本文通过对青蛤进行解剖，直接观察到青蛤内部各组织的连接情况，发现外套膜在青蛤组织生长过程中起到至关重要的作用。青蛤外套膜分泌形成贝壳，并通过环走肌和闭壳肌等肌肉附着在壳内面形成了紧密连接；青蛤外套膜和鳃在内脏团背部生长分化；内脏团与闭壳肌和斧足间通过肌丝内的神经传递信息，进行正常的生命活动；壳与外套膜、闭壳肌和内脏团等组织的连接保证了青蛤整体活动的协调性；青蛤外套膜和水管的特殊连接方式以及水管频繁的伸缩，使其在交汇处形成了特殊的腔状结构。本文对青蛤结构进行深入的探究，重点观察了青蛤组织与贝壳具体的连接方式，系统性分析了青蛤组织间关系，有助于为双壳贝类形态及解剖学研究提供和补充可靠资料。