钙离子胁迫对越南槐种子萌发的影响

马洪娜 王海燕 黄丽容 檀龙颜

（贵州中医药大学，贵州贵阳 550025）

在喀斯特地区土壤中，高浓度钙离子能够显著抑制植物生长，影响农作物产量以及植物种类和群落的分布[1]。檀龙颜等[2]观察了钙离子胁迫对金荞麦（Fagopyrum dibotrys）种子萌发的影响，结果显示，在低浓度钙离子胁迫时，萌发种子主要受到渗透胁迫，细胞通过抗氧化酶清除活性氧自由基，而在高浓度钙离子胁迫时，萌发种子可能受到离子毒害作用。吕朝燕等[3]观察了钙离子胁迫对白车轴草（Trifolium repens）、紫云英（Astragalus sinicus）、紫花苜蓿（Medicago sativa）种子的影响，发现钙胁迫下紫花苜蓿种子恢复萌发率较好、对高浓度钙离子环境的适应能力要好于白车轴草和紫云英，是喀斯特地区较为适宜的栽培牧草品种。冯晓英等[4]分析了钙离子胁迫下伞花木（Eurycorymbus cavaleriei）和华山松（Pinus armandii）幼苗中的脯氨酸和可溶性蛋白含量，结果显示伞花木比华山松更能适应贵州高钙的喀斯特环境。此外，彭 博等[5]观察了不同钙浓度梯度下狭叶香蒲（Typha angustifolia）的生长状况及生理特性，发现狭叶香蒲对高浓度钙胁迫有较强的适应能力，可作为喀斯特湖滨湿地植被恢复及生态重建的理想材料。檀龙颜等[6]研究发现，钙离子胁迫对金荞麦幼叶的影响主要表现为渗透胁迫，在一定程度上解释了金荞麦在贵州成为广布种的原因。檀龙颜等[1]对植物响应钙离子胁迫的机制进行了研究，认为植物通过富集钙离子方式、通过表皮结构将钙离子排出、通过合成渗透保护物质应对钙离子导致的渗透胁迫、通过抗氧化酶系统消除钙离子导致的氧化胁迫、通过固醇甲基转移酶调节钙离子胁迫下膜的完整性、通过增强光合特性适应钙离子胁迫等机制适应高浓度钙离子环境。但是，以高浓度钙离子为非生物胁迫因素的研究较少，而系统性钙离子胁迫研究将为解析喀斯特地区植物的适生机制、品种选育和石漠化治理提供有价值的科学依据。

喜钙植物越南槐（Sophora tonkinensis）为豆科植物，其干燥根和根茎入药称为山豆根[7-8]。山豆根为临床常用药，属清热解毒药[8]。同时，山豆根也是一种重要工业原料。越南槐的繁殖方式主要是种子繁殖[9]。本课题组先期对钙胁迫下越南槐萌发种子的萌发率、含水量、总可溶性糖含量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性和过氧化物酶活性等指标进行了研究，显示钙胁迫对越南槐种子可能产生渗透胁迫[10]。本文在先期研究结果的基础上，研究了其他渗透保护物质（脯氨酸和甜菜碱）含量、电导率、不同活性氧自由基（过氧化氢和超氧阴离子）的含量以及抗氧化酶系统其他主要酶活性，以期为验证和解析越南槐适应贵州喀斯特生境的生理机制提供基础资料，为贵州越南槐规模化种植提供科学指导，为植物响应钙离子胁迫的生理机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为越南槐种子，于2018年9月采自安顺市紫云县猫营镇山豆根种繁基地，室内阴干后，于4℃保存，备用。供试试剂为CaCl2。

1.2 试验方法

试验共设3个处理，即以蒸馏水为对照（CK），50 mmol/L CaCl2溶液（A）、100 mmol/L CaCl2溶液（B）作为钙胁迫处理条件。供试种子采用2%次氯酸钠消毒20 min。每个处理选用50粒大小均匀、饱满的种子，将这些种子置于直径15 cm的培养皿中，基质为2层定性滤纸（蒸馏水充分润湿，无明水）。分别用蒸馏水及50、100 mmol/L CaCl2溶液润湿基质，每天上午9：00定时补充溶液。3次重复。将培养皿置于人工智能气候箱中培养，要求黑暗条件、温度25℃。发芽标准为胚根突破种皮1 mm以上，发芽结束标准为连续5 d无新发芽种子[11]。本试验观察20 d，试验过程中及时补充处理液。

测定指标包含脯氨酸含量、甜菜碱含量、电导率、超氧阴离子含量、过氧化氢含量及抗坏血酸过氧化物酶、单脱氢抗坏血酸还原酶、脱氢抗坏血酸还原酶和谷胱甘肽还原酶活性，测定方法参考文献[12]。

1.3 数据统计及分析

采用Excel 2010和SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 脯氨酸和甜菜碱含量变化

从图1可以看出，处理A越南槐萌发种子中脯氨酸含量与CK之间无明显差异，但是处理B脯氨酸含量与CK相比显著升高。从图2可以看出，越南槐萌发种子中甜菜碱含量变化与脯氨酸含量变化不同，处理A甜菜碱含量与CK相比显著增加，但处理B甜菜碱含量与CK无明显差异。本课题组先前研究发现，总可溶性糖含量随着钙离子浓度的增加逐渐增加[10]。这表明处理A渗透保护物质以总可溶性糖和甜菜碱为主，而处理B渗透保护物质以总可溶性糖和脯氨酸为主。

2.2 电导率变化

从图3可以看出，越南槐萌发种子的电导率随着钙离子浓度的升高表现出先升高后下降的趋势，但处理B越南槐萌发种子的电导率与CK相比仍然较高。本课题组先前研究发现，丙二醛含量随着钙离子浓度的升高呈逐渐增加趋势[10]。以上结果表明，在高浓度钙离子胁迫下，萌发种子的膜发生了氧化性损伤，且发生了电解质泄漏。

2.3 过氧化氢和超氧阴离子含量变化

从图4、5可以看出，越南槐萌发种子中过氧化氢、超氧阴离子的含量随着CaCl2浓度的增加逐渐升高。以上结果表明，在高浓度钙离子胁迫下，细胞内产生了活性氧自由基，引起了细胞氧化性损伤。

2.4 不同处理4种酶活性变化

本课题组前期研究表明，过氧化氢酶活性、超氧化物歧化酶活性和过氧化物酶的活性随着钙离子浓度的增加呈逐渐增强趋势[10]。从图6可以看出，处理A抗坏血酸过氧化物酶活性与CK相比无明显差异，但处理B抗坏血酸过氧化物酶活性与CK相比显著增强。从图7、8、9可以看出，单脱氢抗坏血酸还原酶、脱氢抗坏血酸还原酶和谷胱甘肽还原酶的活性均随着CaCl2浓度的增加而增加。以上结果显示，抗氧化酶系统启动用于活性氧自由基的清除。

3 结论与讨论

3.1 结论

本文研究发现，在CaCl2浓度不超过100 mmol/L时，钙离子胁迫对越南槐种子的胁迫主要为渗透胁迫，种子细胞通过合成甜菜碱和脯氨酸等渗透保护物质维持细胞渗透平衡，渗透胁迫诱导产生的活性氧自由基主要通过抗氧化酶系统清除。

3.2 讨论

3.2.1 越南槐种子通过合成渗透保护物质维持渗透平衡。用不同浓度（0～240 mmol/L）的CaCl2溶液处理提灯藓（Mnium cuspidatum）、石地钱（Reboulia hemisphaerica）、青藓（Brachythecium albicans）3 种苔藓植物配子体发现，随着CaCl2浓度超过40 mmol/L，可溶性糖和脯氨酸含量急剧上升[13]。用含不同浓度CaCl2（0～200 mmol/L）的液体MS培养基培养假马齿苋（Bacopa monnieri）28 d 后发现，与空白对照相比，在150、200 mmol/L CaCl2处理下，甜菜碱含量逐渐升高[14]。本课题组结果显示，越南槐萌发种子通过合成总可溶性糖、脯氨酸和甜菜碱维持细胞渗透平衡，且在50 mmol/L CaCl2处理下，渗透保护物质以总可溶性糖和甜菜碱为主，而在100 mmol/L CaCl2处理下，渗透保护物质以总可溶性糖和脯氨酸为主。渗透保护物质含量的提高能有效降低细胞水势、增强吸水功能，进而抵抗因钙离子浓度提高造成的渗透胁迫[1]。

3.2.2 越南槐种子通过抗氧化酶系统清除活性氧。在高浓度钙离子处理下，单性木兰、伞花木、青冈栎和华山松的过氧化物酶活性随钙离子浓度的增加而增加[15]。 用含不同浓度 CaCl2（0～200 mmol/L）的液体MS培养基培养假马齿苋苗28 d后发现，当CaCl2浓度大于100 mmol/L时，苗中丙二醛含量显著增加[14]；在0～100 mmol/L CaCl2处理下，随着CaCl2浓度的升高，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性逐渐增加，且在100 mmol/L CaCl2处理下抗坏血酸过氧化物酶活性显著高于0、50 mmol/L CaCl2处理[14]。使用含CaCl2（0～200 mmol/L）的培养基培养印度人参苗，苗中过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶活性均随CaCl2浓度的升高而升高[16]。在高浓度钙离子胁迫下，越南槐萌发种子中丙二醛含量增加，膜质遭到氧化[10]，电解质发生泄漏。而超氧阴离子和过氧化氢含量的增加，表明这2种活性氧自由基在膜质氧化过程中发挥了作用（图10）。抗氧化酶活性[10]检测发现，除抗坏血酸过氧化物酶活性在100 mmol/L钙离子浓度下增强外，超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、单脱氢抗坏血酸还原酶、脱氢抗坏血酸还原酶和谷胱甘肽还原酶的活性均随着钙离子浓度的增强而增加（图10）。因此，抗氧化酶系统在活性氧自由基清除过程中发挥了重要作用。