肾衰宁片中黄连6种生物碱类成分含量测定研究

王 健，孙 菡，白 洁，王钰宁，周亚楠*

（1. 秦皇岛市食品药品检验中心，河北 秦皇岛 066000；2. 河北省药品医疗器械检验研究院，河北 石家庄 050000）

肾衰宁片是由太子参、黄连、法半夏、陈皮、茯苓、大黄、丹参、牛膝、红花、甘草等10味中药材组成的复方制剂，具有益气健脾，活血化瘀，通腑泄浊的功效，主要用于治疗脾胃气虚、浊瘀内阻、升降失调所致的面色萎黄、腰痛倦怠、恶心呕吐、食欲不振、小便不利、大便黏滞等疾病。该制剂生产厂家有4个，现行标准有3个，分别为国家药品标准YBZ01622006-2015Z、YBZ07042006、YBZ09322006，标准中均对黄连中盐酸小檗碱进行了含量测定，但方法和含量限度均不相同，且以盐酸小檗碱单一成分作为质量控制指标，无法准确反映药材或制剂的质量，难以达到全面控制药品质量的目的[1-4]。黄连的主要有效成分为生物碱类化合物，其中小檗碱含量最高，此外还有表小檗碱、黄连碱、巴马汀、非洲防己碱、药根碱等生物碱[5-7]。本试验建立同时测定肾衰宁片中盐酸药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱6种黄连生物碱成分含量的方法，为更有效地控制肾衰宁片的质量提供参考。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（Waters e2695，配备PDA检测器，美国Waters公司）；纯水仪（Millipore公司）；超声仪（KQ-500KDE，昆山市超声仪器有限公司）；电子天平（美国Mettler公司， AE163、XPE1126）；甲醇、乙腈为色谱纯，氨水、三乙胺、碳酸氢铵为优级纯；水为超纯水；药根碱对照品、黄连碱对照品、盐酸巴马汀对照品、盐酸小檗碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为110733-201909，112026-201601，110732-201611，110713-201212）；非洲防己碱对照品、表小檗碱对照品（成都曼斯特生物科技有限公司）；肾衰宁片22批，来自国内4家药品企业。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：资生堂 AQ C18（5 µm，4.6 mm×250 mm）；以乙腈（A）-0.06 mol/L碳酸氢铵溶液（每100 ml含1.4 ml浓氨水和0.3 ml三乙胺）（B）为流动相，梯度洗脱：0～9 min，23 % A；9～15 min，23 %→25 % A；15～50 min，25 %→45 % A；检测波长：345 nm；进样量：10 µl；柱温：30 ℃；流速为1.0 ml/min。

2.2 标准溶液的制备

取盐酸药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀对照品适量，分别加甲醇适量，超声使溶解并稀释制成含量为0.479，0.528，0.484，0.509，0.193 mg/ml对照品贮备液。取盐酸小檗碱对照品约9 mg，精密称定，置入100 ml量瓶；再分别精密量取盐酸药根碱对照品贮备液1.0 ml、非洲防己碱对照品贮备液2.0 ml、表小檗碱对照品贮备液2.0 ml、盐酸黄连碱对照品贮备液5.0 ml、盐酸巴马汀对照品贮备液10.0 ml，置入含盐酸小檗碱对照品的量瓶，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品，研细，取粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（100:1）的混合溶液25 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率700 W，频率80 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇-盐酸（100:1）的混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液制备

按照处方和制法，制备不含黄连的阴性样品，按2.3项下方法制备阴性样品溶液，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性试验 分别取上述混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，于2.1项色谱条件下测定，结果见图1。由图1可见，在该色谱条件下，6种成分色谱峰分离度良好，理论塔板数按盐酸小檗碱计大于5000，阴性无干扰。

图1 混合对照品和样品的液相色谱图

2.5.2 线性关系考察 分别精密量取盐酸药根碱对照品溶液（浓度0.000 698 mg/ml 5，10，20 μl；浓度0.005 82 mg/ml 5，10，20 μl；浓度0.023 29 mg/ml 10 μl），非洲防己碱对照品溶液（浓度0.000 797 mg/ml 5，10，20 μl；浓度0.00664 mg/ml 5，10，20 μl；浓度0.026 57 mg/ml 10 μl），表小檗碱对照品溶液（浓度0.001 45 mg/ml 5，10，20 μl；浓度0.012 10 mg/ml 5，10，20 μl；浓度0.048 4 mg/ml 10 μl），盐酸黄连碱对照品溶液（浓度0.002 95 mg/ml 5，10，20 μl；浓度0.024 58 mg/ml 5，10，20 μl；浓度0.098 3 mg/ml 10 μl），盐酸巴马汀对照品溶液（浓度0.003 02 mg/ml 5，10，20 μl；浓度0.025 15 mg/ml 5，10，20 μl；浓度0.1006 mg/ml 10 μl），盐酸小檗碱对照品溶液（浓度0.010 28 mg/ml 5，10，20 μl；浓度0.085 7 mg/ml 5，10，20 μl；浓度0.342 8 mg/ml 10 μl），注入液相色谱仪，按拟定的色谱条件测定，记录峰面积。以对照品进样量（μg）为横坐标，对照品的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程。结果见表1，表明各成分线性关系良好。

表1 各成分线性关系结果

2.5.4 重复性试验 取肾衰宁片样品（批号：20181001），研细，分别称取0.25，0.5，0.75 g各3份，精密称定，按2.3项下方法平行制备9份供试品溶液，进行测定，计算得各待测成分的平均含量（n=9）及RSD值，结果见表2，表明该方法重复性良好。

表2 肾衰宁片中含量测定稳定性、重复性试验结果

2.5.5 稳定性试验 取肾衰宁片样品（批号：20181001），研细，取细粉0.5 g，精密称定，按2.3项下配制供试品溶液，分别于制备后0，3，6，12，16，24 h进样分析，计算各成分峰面积RSD值，结果见表2。表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.5.6 加样回收试验 取肾衰宁片样品（批号：20181001），研细，取0.25 g，精密称定，每3份为一组，分别精密加入用溶液配制的低、中、高（低、中、高浓度各成分质量浓度分别为盐酸药根碱0.0014，0.0028，0.0056 mg/ml；非洲防己碱0.0016，0.0032，0.0085 mg/ml；表小檗碱0.0039，0.0058，0.0098 mg/ml；盐酸黄连碱0.0044，0.0079，0.0147 mg/ml；盐酸巴马汀0.0038，0.0077，0.0154 mg/ml；盐酸小檗碱0.0213，0.0444，0.0639 mg/ml）3个浓度的混合对照品溶液25 ml，按2.3项下方法平行制备9份供试品溶液，进行测定，计算盐酸药根碱、非洲防己碱、盐酸黄连碱、表小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱6个成分的加样回收率及RSD，结果见表3，表明本方法回收率良好。

表3 回收率试验结果

表3（续）

2.6 样品测定结果

将全部肾衰宁片样品（共22批），分别按2.3项下方法制备供试品溶液，每批次平行3份，按2.1项下色谱条件测定，用外标法分别计算盐酸药根碱、非洲防己碱、盐酸黄连碱、表小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱6种成分的含量，结果见表4。

表4 样品中6种成分含量测定结果/mg·g-1（n=3）

3 讨论

3.1 提取方式及溶剂考察

文献中黄连的提取溶剂多用甲醇或甲醇-盐酸[8-9]，本实验方法中对供试品制备过程中提取方式（超声、回流）及提取溶剂（甲醇、盐酸-甲醇）进行了考察，结果表明，用甲醇-盐酸（100:1）为提取溶剂，超声处理30 min时 6 种生物碱质量分数较高。

3.2 色谱条件及检测波长的选择

本实验分别考察了乙腈-0.1 %磷酸（每1000 ml磷酸溶液中 加2 ml三乙胺）、乙腈-0.1 %磷酸、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液等流动相条件，上述流动相均未能使盐酸药根碱与非洲防己碱达到基线分离。最终选择乙腈-0.06 mol/L碳酸氢铵溶液为流动相，色谱峰分离度较好[10]。采用PDA检测器于200～400 nm 波长进行UV全波长扫描，结果6种生物碱均在345 nm波长有较大吸收，同时结合分析文献报道情况[11-12]，选择345 nm 为检测波长。

3.3 耐用性考察

取肾衰宁片样品，分别采用不同品牌的液相色谱仪及色谱柱，进行测定盐酸药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱含量。结果含量测定结果RSD值均小于3 %，表明方法耐用性良好。

3.4 结论

本实验采用HPLC对肾衰宁片中盐酸药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱6种黄连生物碱成分含量进行测定，方法的专属性、重复性、准确性、稳定性均较好。测定的22批样品结果表明，不同批次间样品测定结果存在一定的差异。相对于现行标准对盐酸小檗碱的单成分含量测定，多组分的含量测定更能全面反映样品中黄连饮片的质量，能更加科学地评价药品质量，为提高该制剂的质量标准奠定基础。