拓扑异构酶I抑制剂喜树碱对小鼠急性胰腺炎保护机制的研究

包静飘 李彬 吴江红 吴增楷 沈杰 宋鹏丽 彭琪 胡国勇

上海市胰腺疾病重点实验室，上海交通大学医学院附属第一人民医院消化科，上海 200080

腺泡细胞死亡是AP的重要特征之一，其中坏死和凋亡是腺泡细胞死亡的两种主要方式[1]。AP的严重程度与腺泡细胞的死亡方式密切相关，重症急性胰腺炎时通常伴随大量的腺泡细胞坏死，可引起强烈的胰腺局部炎症反应，并导致全身炎症反应综合征和远端脏器损伤，而诱导细胞凋亡则可减轻胰腺损伤[2-4]。本课题组前期研究证实胰腺腺泡细胞坏死和凋亡的比例决定了AP的严重程度[5]。因此，在AP发生的早期重塑腺泡细胞死亡方式可能是治疗及预防AP重症化演变的有效手段。为寻找有效调控AP时腺泡细胞死亡方式的药物，本课题组利用Sigma-Aldrich药理活性小分子化合物库进行筛选，发现拓扑异构酶I抑制剂喜树碱与腺泡细胞凋亡相关。喜树碱是一种特异性拓扑异构酶I抑制剂，通过形成稳定的喜树碱-拓扑异构酶I-DNA复合物导致DNA损伤，使细胞周期停滞在S期，最终诱导细胞凋亡[6]。本研究通过建立小鼠AP模型，观察喜树碱对AP严重程度和腺泡细胞死亡方式的影响，旨在探讨喜树碱在AP及腺泡细胞死亡中的作用，为寻找新型有效的AP治疗药物提供理论依据。

材料与方法

一、动物模型制备及分组

18只雄性8周龄Balb/C小鼠，体重20～25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。将小鼠按数字表法随机分为对照组、AP组和喜树碱干预组(喜树碱组)，每组6只。AP组采用腹腔注射雨蛙肽(100 μg/kg，10次，美国MCE公司)，每次间隔1 h，末次雨蛙肽注射后再注射脂多糖(5 mg/kg，美国Sigma公司)的方法制备AP模型；喜树碱组于AP造模前0 h腹腔注射喜树碱(美国Sigma公司)；对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水。为确定喜树碱在AP时发挥作用的最佳浓度，先应用25 mg/kg和50 mg/kg的剂量对AP造模组小鼠进行干预。各组于首次注射雨蛙肽后12 h处死小鼠，眼眶取血，剖腹取胰腺和肺组织。

二、观察指标

1.胰腺和肺组织病理学检查：胰腺和肺组织置于4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色。胰腺组织根据水肿、炎症和坏死程度进行病理评分[7]，肺组织根据肺泡壁水肿和炎症细胞浸润程度进行病理评分[8]。

2.血清淀粉酶和脂肪酶检测：采用ELISA试剂盒测定血清淀粉酶和脂肪酶水平，按说明书操作。

3.胰腺组织IL-1β、IL-6 mRNA表达检测：采用Trizol试剂(日本Takara公司)提取胰腺组织总RNA，并按PrimeScript RT Master Mix试剂盒(日本Takara公司)说明书将RNA逆转录成cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(日本Takara公司)进行RT-PCR。IL-1β上游引物序列为5′-ATGCCACCTTTTGACAGTGATG-3′，下游引物序列为5′-TGATGTGCTGCTGCGAGATT-3′；IL-6上游引物序列为5′-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3′，下游引物序列为5′-CATTTCCACGATTTCCCAGA-3′；内参GAPDH上游引物序列为5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下游引物序列为5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′。PCR反应条件：95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 34 s，40个循环。采用公式2-△△CT计算IL-1β、IL-6 mRNA的相对表达量。

4.胰腺和肺组织CD45+细胞和程序性坏死标志蛋白混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL)磷酸化表达水平检测：采用免疫组织化学法检测胰腺及肺组织CD45+细胞数量及胰腺组织磷酸化MLKL蛋白表达量，按照试剂盒说明书操作。CD45单克隆抗体(美国CST公司)和磷酸化MLKL单克隆抗体(美国Abcam公司)工作浓度均为1∶100。CD45阳性表现为胰腺间质、肺间质或肺泡腔内出现紫红色颗粒，光镜下每个样本随机选取5个高倍镜视野(200倍)，计数每个视野中CD45阳性细胞数量。磷酸化MLKL蛋白表达阳性为腺泡细胞胞质呈棕色，每个样本随机选取5个高倍镜视野，根据腺泡细胞棕色染色强度及阳性细胞率进行评分。无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞率0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76～100%为4分。两评分相乘为总评分。

5.胰腺组织凋亡细胞检测：采用TUNEL法检测胰腺组织细胞凋亡。凋亡试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，按照说明书操作。凋亡指数=(凋亡细胞总数/总细胞数)×100%。

三、统计学处理

结 果

一、喜树碱减轻AP小鼠胰腺和肺组织损伤

对照组小鼠胰腺和肺组织均无明显病理改变。AP组小鼠胰腺组织呈现明显的间质水肿、炎症细胞浸润和腺泡细胞坏死，肺组织见肺泡壁明显水肿、增厚，炎症细胞浸润增加。腹腔注射50 mg/kg喜树碱干预的AP小鼠胰腺和肺组织的上述病理变化较AP组和25 mg/kg喜树碱干预组均有明显改善(图1)。因此，后续实验均采用50 mg/kg剂量进行干预。

AP组胰腺、肺组织病理评分均明显高于对照组，而喜树碱组显著低于AP组，差异有统计学意义(P值均<0.05，表1)。AP组小鼠血清淀粉酶和脂肪酶水平较对照组均显著升高，喜树碱组淀粉酶和脂肪酶水平较AP组均显著降低，差异有统计学意义(P值均<0.05，表1)。提示喜树碱能有效减轻AP小鼠胰腺和肺组织损伤。

表1 3组小鼠胰腺和肺组织病理评分及血清淀粉酶和脂肪酶水平的比较

二、喜树碱缓解AP小鼠胰腺和肺组织的炎症反应

对照组、AP组、喜树碱组小鼠胰腺组织中IL-1 mRNA表达量分别为1.39±1.12、212.35±80.61、95.79±48.11，IL-6 mRNA表达量分别为1.11±0.55、1006.80±509.06、255.50±213.32，AP组均较对照组显著升高，喜树碱组较AP组显著降低，差异有统计学差异(P值均<0.05)。

对照组、AP组、喜树碱组小鼠胰腺组织CD45+细胞浸润的数量分别为(0.33±0.58)、(59.83±13.67)、(14.25±5.32)个/高倍视野，肺组织CD45+细胞浸润的数量分别为(45.00±4.24)、(58.24±5.91)、(29.20±4.44)个/高倍视野，AP组均显著高于对照组，而喜树碱组显著低于AP组(图2)，差异有统计学意义(P值均<0.05)。提示喜树碱能显著减轻AP小鼠胰腺和肺组织的炎症反应。

图2 对照组、急性胰腺炎组、喜树碱组小鼠胰腺组织(2A～2C)和肺组织(2D～2F)CD45+细胞浸润(免疫组织化学染色 ×200)

三、喜树碱诱导AP小鼠胰腺细胞凋亡并抑制细胞坏死

对照组、AP组、喜树碱组小鼠胰腺腺泡细胞凋亡指数分别为(0.58±0.43)%、(1.92±0.29)%、(3.64±1.16)%，喜树碱组较AP组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。提示喜树碱能显著诱导AP小鼠胰腺腺泡细胞凋亡。

对照组、AP组、喜树碱组小鼠胰腺磷酸化MLKL蛋白的免疫组织化学评分分别为(0.56±0.19)、(4.53±1.28)、(1.75±0.20)分，喜树碱组显著低于AP组(图3)，差异有统计学意义(P<0.05)。提示喜树碱能显著抑制AP小鼠胰腺腺泡细胞坏死。

注：MLKL为混合谱系激酶结构域样蛋白

讨 论

本课题组前期研究证实[5]，AP的严重程度与腺泡细胞坏死呈正相关，与凋亡呈负相关。为进一步探究调控腺泡细胞死亡方式的分子机制，本课题组通过药理活性小分子化学库筛选影响腺泡细胞存活的潜在靶点。筛选结果提示拓扑异构酶I抑制剂喜树碱可能参与调控AP时腺泡细胞凋亡。喜树碱是拓扑异构酶I的特异性抑制剂，多项研究表明喜树碱能够诱导细胞的凋亡[9-14]。早期研究发现，喜树碱在活化的人外周血淋巴细胞中可以促进细胞周期从G1期向S期转变，诱导细胞凋亡[11]。Liu等[15]在人角质形成细胞中的研究提示，喜树碱能够抑制端粒酶活性，从而促进细胞凋亡。另外，研究表明喜树碱能通过增加胞质内Ca2+和降低线粒体膜电位影响线粒体功能，进而调控细胞凋亡[16-17]。Zeng等[18]在肿瘤细胞中证实喜树碱促进Bak1和Mcl1蛋白的表达，通过线粒体途径诱导细胞凋亡。喜树碱还可以引起细胞内活性氧水平和DNA损伤显著增加，促进氧化应激，从而调控细胞死亡[19]。此外，Kobayashi等[20]研究结果显示，喜树碱诱导人中性粒细胞凋亡的同时，能显著下调IL-18和Toll样受体-6等炎症相关分子的表达，抑制其促炎作用。然而，拓扑异构酶I抑制剂对AP及腺泡细胞死亡的影响，尚无文献报道。

本研究结果显示，喜树碱能有效减轻AP小鼠胰腺病理损伤，减少胰腺组织CD45+细胞浸润数量和降低炎症细胞因子表达量；同时，经喜树碱干预后，AP小鼠胰腺炎相关肺损伤显著减轻，肺组织CD45+细胞浸润数量也明显减少。提示喜树碱能有效减轻AP小鼠胰腺损伤及相关肺损伤，减轻局部和全身炎症反应。此外，为研究拓扑异构酶I抑制剂对AP腺泡细胞死亡的影响，本研究进一步检测了小鼠胰腺腺泡细胞凋亡指数和程序性坏死标志蛋白MLKL的磷酸化水平，结果显示喜树碱干预组小鼠胰腺细胞凋亡指数明显升高，而MLKL磷酸化水平明显降低。

综上所述，拓扑异构酶I抑制剂喜树碱可能通过重塑AP小鼠腺泡细胞死亡方式减轻胰腺局部损伤及相关肺损伤，从而为AP的临床治疗提供新的思路和靶点。鉴于拓扑异构酶I抑制剂能通过多种途径调控细胞死亡，未来的研究将聚焦于其在AP时腺泡细胞死亡中的具体机制。

利益冲突所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明包静飘、吴江红、李彬：实验操作、论文撰写；吴增楷、沈杰、宋鹏丽、彭琪：数据整理、统计学分析；胡国勇：研究指导、论文修改、经费支持