江苏省域草莓灰霉病菌种群多药剂抗性检测

肖 婷，钱荣明，张富荣，周 斌，吴惠秋，季 森，宋俊贤，庄义庆，杨敬辉

（1江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏句容 212400；2南京市溧水区植保植检站，南京 211000；3徐州市铜山区植保植检站，江苏徐州 221000；4昆山市耕地质量与植物保护站，江苏昆山 215300；5泰州市姜堰区植保植检站，江苏泰州 225500；6无锡市农业技术推广总站，江苏无锡 214000；7常州市新北区农业农村综合管理服务中心，江苏常州 213000）

0 引言

草莓味美多汁，酸甜可口，是深受消费者喜爱的水果。改革开放以来，随着经济发展、人民生活水平提高，草莓消费需求不断扩大。江苏省草莓产业几乎是从零起步，有了很大发展，目前全省栽培面积超达1.7万hm2，分布遍及全省，并形成了东海、赣榆、如皋、句容等较大的集中产区，成为全国的草莓大省。种草莓成为很多地方农民调整产业结构，发展高效农业，实现增收致富的好项目。草莓的栽培方式也已经从露地栽培转换到大棚栽培为主，上市时间为每年11月下旬至第二年5月初，上市期间为了保温，大棚均需要加盖双层塑料棚膜，在这种封闭的生长条件下，灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的草莓灰霉病很容易大范围发生并流行，这是一种世界性病害，在很多蔬菜水果上均有发生[1]。

目前，生产上防治灰霉病的主打药剂种类有苯并咪唑类、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（以下简称QoI）类、琥珀酸脱氢酶抑制剂（简称SDHI）类，苯胺基嘧啶类等药剂[2-3]。本研究调查了江苏省草莓主产区用来防控草莓灰霉病的主要药剂，有腐霉利、扑海因、嘧霉胺、嘧菌环胺等，同时结合市场上销售的防控灰霉药剂，筛选出13种药剂用来检测省域范围内草莓灰霉的抗药性水平。这些杀菌剂如嘧菌酯[4]、吡唑醚菌酯[5-6]、多菌灵[7]、嘧霉胺、嘧菌环胺都是单一作用位点杀菌剂，如果长期、多频次使用，抗药性会快速发展，另外很多地区对异菌脲[7-8]、啶酰菌胺[9-10]等药剂产生了多重抗药性。关于灰霉病菌抗药性方面的报道，国内外很多期刊屡见不鲜。本研究连续2年系统检测江苏省主要草莓种植地区灰霉病菌种群对13种常用杀菌剂的抗药性水平，并阐明不同草莓种植地区灰霉病菌种群的多药剂优势亚种群，因地制宜提出抗药性治理策略，以期为江苏省草莓灰霉病菌防治提供参考。

1 材料和方法

1.1 菌株的采集、分离和鉴定

2019、2020年4月分别收集到江苏省南京溧水市、常州新北市、苏州昆山市、泰州市、无锡市、徐州市以及镇江市十几个草莓园区随机采取的草莓灰霉病菌，经过实验室分离，挑单胞培养和鉴定，确定其为灰葡萄孢(Botrytis cinereaPers.)。共分离得到236株草莓灰霉病菌菌株（菌株信息见表1），所有菌株采用滤纸片法保存，置于-20℃冰箱中，备用。

表1 菌株信息

1.2 供试药剂

供试药剂信息见表2。

表2 药剂信息

1.3 抗药性检测方法

1.3.1 多菌灵、咪鲜胺、腐霉利和戊唑醇的抗药性检测方法 采用区分剂量法测定供试菌株对多菌灵、咪鲜胺、腐霉利和戊唑醇的抗药性，多菌灵、咪鲜胺、腐霉利和戊唑醇的区分剂量分别设置为10、5、10、5 mg/L[11]，培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA北京奥博星生物技术有限公司），以不含药剂者为对照(CK)，接种后23℃培养3天观察，平板上正常生长的为抗性菌株，不能正常生长的为敏感菌株。所有抗性菌株均进行2次重复测定确认。

1.3.2 扑海因、吡唑醚菌酯和环酰菌胺的抗药性检测方法 采用区分剂量法测定供试菌株对扑海因、吡唑醚菌酯和环酰菌胺的抗药性，扑海因和吡唑醚菌酯的区分剂量均设置为10 mg/L[12]，环酰菌胺的区分剂量设置为5 mg/L，培养基采用1%MEA(Malt extract agar)培养基，包含氯霉素麦芽提取物琼脂（青岛海博生物科技有限公司）和琼脂粉，以不含药剂者为对照(CK2)，为防止旁路氧化[13]，嘧菌酯和吡唑醚菌酯及其对照培养基(CKS)中均含有SHAM 100 mg/L（SHAM：99%水杨肟酸(salicylhydroxamic acid)，由 Sigma-Aldrich 公 司 生产，溶于甲醇，配制成20000 mg/L的母液。均放于4℃保存备用。23℃培养3天后观察，平板上正常生长的为抗性菌株，不能正常生长的为敏感菌株。所有抗性菌株均进行2次重复测定确认。

1.3.3 啶酰菌胺、氟吡菌酰胺和氟唑菌酰胺的抗药性检测方法 采用区分剂量法测定供试菌株对啶酰菌胺、氟吡菌酰胺和氟唑菌酰胺抗药性，其区分计量为10 mg/L和5 mg/L[14]，培养用培养基为YBA培养基，制作药皿，设不加药剂空白对照(CK1)，23℃培养2天后观察。平板上病菌孢子正常萌发、菌丝正常生长的确定为抗性菌株，不能正常生长的确定为敏感菌株。所有抗性菌株均进行2次重复测定确认。

1.3.4 嘧霉胺、嘧菌环胺和咯菌腈的抗药性检测方法采用区分剂量法测定供试菌株对嘧霉胺和嘧菌环胺抗药性，其区分计量为5 mg/L，咯菌腈为0.5 mg/L，培养用培养基为CZA培养基，制作药皿，设不加药剂空白对照(CK3)，23℃培养2天后观察。平板上病菌孢子正常萌发、菌丝正常生长的确定为抗性菌株，不能正常生长的确定为敏感菌株。所有抗性菌株均进行2次重复测定确认。

1.4 数据分析

统计不同地区不同药剂抗性菌株数量，分析其抗性水平。所有抗性菌株均进行2次重复测定确认。不同采样点菌株抗性频率计算见公式(1)。

统计分析抗性菌株的多药剂抗性类型。

2 结果与分析

2.1 草莓灰霉病菌种群对药剂的敏感性检测结果

为准确快速区分出供测菌株对13种药剂的敏感性，以药皿上灰霉孢子正常萌发生长的判定为抗性菌株，反之判定为敏感菌株。结果表明，2019年（119株）和2020年（117株）采集的236株灰霉病菌菌株中未检测到对咯菌腈产生抗药性的菌株，所有供试菌株对咯菌腈表现敏感，而对多菌灵、腐霉利、扑海因、吡唑醚菌酯产生抗性的菌株比例较高。2019年供试菌株中对多菌灵产生抗性的菌株比例高达51.92%，其次为扑海因46%，嘧霉胺43.35%，吡唑醚菌酯42.63%，腐霉利42.48%。2020年所采集的菌株对多菌灵、腐霉利、扑海因和吡唑醚菌酯抗性频率均有所上升（图1），抗性频率分别为64.17%、49.11%、56.87%和67.39%。其中对戊唑醇的抗性频率从2019年的6.06%上升到2020年的48.02%，嘧菌环胺和嘧霉胺的抗性频率均有所下降。

图1 2019年和2020年草莓灰霉病菌对13种药剂的抗性频率分布

2.2 不同地区草莓灰霉病菌种群对药剂的抗药性频率

由图2可知，不同地区由于施药水平不同，用药品种不同，管理模式不同，从而同一地区对不同药剂的抗药性水平具有显著差异，不同地区对于同一药剂的抗性水平也存在显著性差异。

图2 不同地区草莓灰霉病菌菌株对13种药剂的抗药性频率

2019年南京溧水地区供测菌株对咪鲜胺、氟吡菌酰胺、环酰菌胺、咯菌腈敏感，对多菌灵、扑海因、吡唑醚菌酯、嘧菌环胺和嘧霉胺的抗性频率高达91.67%，其次是腐霉利和啶酰菌胺，抗性频率为75%和66.67%。2020年采自南京溧水的30株菌株，对咪鲜胺、氟唑菌酰胺、环酰菌胺和咯菌腈敏感，对多菌灵、扑海因和吡唑醚菌酯的抗性频率超过70%，相较于2019年有所下降，对氟吡菌酰胺和嘧菌环胺的抗性频率仅有6.66%。

2019年苏州昆山地区供测菌株对咪鲜胺、环酰菌胺、咯菌腈敏感，对多菌灵、腐霉利、扑海因、吡唑醚菌酯的抗性频率高达90%以上，抗性较高的还有嘧霉胺为85%、嘧菌环胺为70%、啶酰菌胺为40%。2020年采自苏州昆山的26株菌株全部对氟唑菌酰胺、环酰菌胺和咯菌腈敏感，其中有2株对咪鲜胺敏感性下降；与2019年相比供测菌株对多菌灵、腐霉利、啶酰菌胺、扑海因、吡唑醚菌酯抗性频率略有下降，对戊唑醇的抗性频率有大幅度的提高。

2019年常州新北地区整体抗性水平较低，供测菌株对啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、环酰菌胺、嘧菌环胺和咯菌腈敏感，对多菌灵的抗性频率最高，仅有27.78%。2020年常州新北采集的14株菌株对氟唑菌酰胺、环酰菌胺、咯菌腈敏感，对其他药剂的抗药性均有不同程度的升高，其中对戊唑醇的抗性频率由2019年的5.55%上升至56.25%，对多菌灵、腐霉利、扑海因、吡唑醚菌酯的抗性频率均上升到40%以上。

2019年泰州地区供测菌株对咪鲜胺、戊唑醇、氟吡菌酰胺、环酰菌胺和咯菌腈敏感，对多菌灵、腐霉利、扑海因、吡唑醚菌酯、嘧霉胺和嘧菌环胺的抗性频率高达40%～65%。2020年供测菌株对多菌灵、戊唑醇、啶酰菌胺、扑海因和吡唑醚菌酯的抗性频率均有上升，其中戊唑醇的抗性频率上升了38.46%，上升最多，而对腐霉利、氟唑菌酰胺、嘧霉胺和嘧菌环胺的抗性频率均有所下降。

2019和2020年无锡地区的检测结果显示，供试菌株对检测药剂的抗性频率较低，均低于20%。2019年未检测到对咪鲜胺、氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、环酰菌胺、咯菌腈产生抗性的菌株，2020年未检测到对多菌灵、腐霉利、啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、嘧霉胺、嘧菌环胺和咯菌腈产生抗性的菌株。该地区以敏感菌株为优势种群。

2019年徐州地区供测菌株监测结果显示，供测菌株对咪鲜胺、戊唑醇、嘧菌环胺和咯菌腈敏感，对多菌灵的抗性频率最高，高达66.67%，对其他药剂的抗性频率分布在22%～33%之间，2020年，供测菌株对多菌灵、腐霉利、戊唑醇、吡唑醚菌酯、嘧霉胺、嘧菌环胺的抗性频率均有大幅度提高，对其他药剂的抗性频率均有不同程度下降，两极分化比较明显。

2019年镇江供测菌株对供试药剂的抗性频率普遍偏低，2020年供测菌株对多菌灵(77.78%)、腐霉利(77.78%)、戊唑醇(55.56%)、扑海因(88.89%)和吡唑醚菌酯(77.78%)的抗性频率较高，对其他药剂均表现敏感。

2.3 草莓灰霉病菌种群抗药性分析

由图3可知，在区分计量浓度下，测定了各药剂对供试菌株的抑菌率，结果显示：供试菌株对咪鲜胺、咯菌腈、环酰菌胺、氟唑菌酰胺、氟吡菌酰胺敏感，未发现或发现极少量抗性菌株，而且，药剂对抗性菌株的抑菌率高达90%以上；供试菌株对戊唑醇、啶酰菌胺、嘧菌环胺抗性频率在20%～25.4%，对腐霉利、扑海因的抗性频率在58%～63%，虽然供试菌株对此5种药剂的抗性频率存在显著性差异，但是药剂对抗性菌株的抑菌率主要分布在70%以上，相比之下，供试菌株对多菌灵、吡唑醚菌酯和嘧霉胺的抗性频率是64.40%、55.93%和35.04%，但多菌灵和嘧霉胺对抗性菌株的抑菌率均在10%以下，吡唑醚菌酯对抗性菌株的抑菌率主要分布在20%～30%。

图3 各药剂对供试菌株抑菌率分布

2.4 草莓灰霉病菌种群的多药剂抗性表型分析

由图4可知，根据试验结果，重点选取了多菌灵(Car)、啶酰菌胺(Bos)、吡唑醚菌酯(Pyra)和嘧霉胺(Pyr)分析多药剂抗性类型。结果表明，选取的123株抗性菌株，其抗药性类型共有9种，单抗菌株有3种类型，分别为Pyra（R9株）、Car（R8株）和Pyr（R1株），占总抗性菌株中的比率为14.63%；双抗菌株有3种类型，分别为CarRPyr（R4株）、CarRPyra（R20株）和CarRBos（R1株），占总抗性菌株中的比率为20.32%；三抗菌株有2种类型为CarRPyraRPyr（R29株）和CarRBosRPyra（R9株），占总抗性菌株中的比率为30.89%，四抗菌株CarRBosRPyraRPyr（R42株），占总抗性菌株中的比率为34.15%。

图4 2019年和2020年江苏省草莓灰霉病菌对4种药剂的多药剂抗性类型

2019年多药剂抗性类型以三抗CarRPyraRPyrR)和四抗(CarRBosRPyraRPyrR)为主要类型，分别占2019年抗性菌株总数的36.21%和41.37%，其他类型比较少。2020年多药剂抗性类型以双抗(CarRPyraR)和四抗(CarRBosRPyraRPyrR)数量最多，均占2020年抗性菌株总数的27.69%，其次是单抗类型(PyraR)和三抗类型(CarRPyraRPyrR和 CarRBosRPyraR)，占 2020年测定菌株总数的13.85%、12.31%和12.31%。总体来看，供测菌株以四抗类型为主，其次是三抗类型CarRPyraRPyrR。

3 讨论

本项目组测定的2019年和2020年的236株草莓灰霉病菌菌株，均由当地植保植检部门在本区域常年种植草莓基地采集，采集地区相对集中，数量虽少，但均有一定的代表性。供测菌株中，抗性菌株数量高达159株，其中2019年63株，占2019年供测菌株的52.9%，2020年96株，占2020年供测菌株的82.05%，由此看来，抗性菌株比例有上升的趋势。笔者曾经测定了上海地区2016年和2017年采集的草莓灰霉病菌菌株，抗性菌株比例也呈上升趋势[15]。从单个药剂分析来看，仍然是多菌灵的抗药性稳居榜首，这与文献报道中，江苏省南京溧水市、镇江市草莓灰霉病菌对多菌灵产生了很高的抗药性结果一致[16]。从2年的结果看，药剂的使用频次与抗性水平呈正相关，连续使用同一种药剂防治，同一地区灰霉菌株抗性呈上升趋势，且上升速度较快，轮换使用或间隔使用，抗性水平会略有下降，但同一类型药剂之间会存在交互抗性[17]。2007年礼茜等[4]就报道浙江省2个地区已检测出对扑海因产生的抗药性达24%，2016年徐州市草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性也高达53.76%[18]，随着时间的推移，各地的抗药性水平都有上升趋势，即便是以敏感种群为主的地区，也需要在生产中注意药剂的使用次数和轮换交替用药的原则，保持田间菌株的敏感性，延长各种药剂的使用寿命，高度重视草莓灰霉病菌的抗性问题[19-20]。

同时，药剂敏感性下降并不意味着就失去了使用价值，本研究分析了检测药剂的抑菌率，从而将供测药剂分为3种类型：（1）敏感性药剂，供试菌株对这一类药剂敏感，未发现或发现极少量抗性菌株，田间仍以这类药物的敏感菌株作为优势种群，如咪鲜胺、咯菌腈[21]、环酰菌胺、氟唑菌酰胺、氟吡菌酰胺。（2）敏感性下降的药剂，这一类包含2种情况，一是像戊唑醇、啶酰菌胺、嘧菌环胺这类药剂[22]，供试菌株的抗性频率较低，部分菌株对这几种药剂产生抗药性，敏感菌株频率占80%以上，抗性菌株的抑菌率也都集中在80%以上，该药剂在田间还是具有较好的使用效果；二是像腐霉利、扑海因这2种药剂，虽然供试菌株中大部分都对此药剂产生了抗药性[23]，抗性频率较高，但抗性倍数不高，各药剂的抑菌率均集中在70%以上，此类菌株的抗性倍数在逐步发展过程中，即该类药剂对田间菌株的抑菌率是逐渐下降的，下降速度与使用浓度和使用次数呈正相关，此类药剂对于灰霉病依然有一定的防治效果，而且通过加大使用浓度和增加使用次数，可以提高防治效果。如果不加以治理，这一类药剂很容易发展成为第三类药剂。（3）即高抗性药剂，如多菌灵[24]、嘧霉胺、吡唑醚菌酯，田间采集到的菌株对此类药剂的抗药性频率较高，而且这类药剂对抗性菌株的抑菌率大都在30%以下，即使加大用药剂量和增加使用次数，防治效果也收效甚微。

另外，并不是病原菌产生了抗药性的药剂就失去了防治效果，产生了高频率抗药性的药剂就没有了使用价值，病原菌对腐霉利和扑海因的抗药性频率分别高达45.79%和51.43%，两者之间不存在显著性差异，但在区分计量浓度下，腐霉利对抗性菌株的抑菌率分布在60%～100%之间，而扑海因对抗性菌株的抑菌率分布在40%～80%之间，在田间使用过程中，提高药剂的使用浓度和使用次数，对草莓灰霉病的防治依然可以达到较好的效果。但是第三类药剂在区分计量浓度下，各药剂对抗性菌株的抑菌率均低于10%，即使加大药剂浓度或用药次数，该类药剂对抗性菌株的防治效果也微乎其微，因此一旦菌株对此类药剂产生的抗药性频率较高，则要考虑更换药剂[25-26]。由此可以区分对待，为指导农户用药提供科学依据。

从药剂的多药剂抗性类型分布来看，田间草莓灰霉病菌的多药剂抗性类型以CarRPyraR、CarRPyraRPyrR、和CarRBosRPyraRPyrR为主，2年来，多药剂抗性缓慢发展，本项目组在2016—2017年连续检测上海地区灰霉病菌的多种抗药性发现其单抗菌株在逐渐向双抗菌株发展，三抗菌株逐渐向四抗菌株发展，而且随着药剂的使用，单抗类型比例减少，逐渐向多抗类型演变[15]。江苏省各地县市区近几年来一直大力推广草莓绿色综合防控技术，指导农户在生产过程中要注意不同种类药剂的轮用混用，避免抗药性的快速发展，部分地区在抗药性治理方面成效显著。