鸭坦布苏病毒分离鉴定及其囊膜蛋白遗传进化分析

阴雅洁，梁瑞英，崔 欢，孟利佳，倪维玲，乔思娜，郭康康，张 博，李松励，侯绍华，董世山

（1.河北农业大学动物医学院，保定 071000；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193）

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）引起的一种以患病鸭采食量和产蛋量大幅下降、出现严重的神经功能障碍为特征，以出血性卵巢炎为主要临床症状的鸭传染性疾病。自2010年以来，该病毒已在中国主要养鸭区传播，广东、广西、福建、江西、上海等很多地区都有DTMUV感染的报道，从鹅、鸡、麻雀和蚊子中也分离得到DTMUV[1-5]。鸭群感染后几乎全部发病，死亡率为5%～15%不等，并且DTMUV感染会导致鸭群抵抗力下降，使其更易混合感染一些细菌性疾病，严重危害了中国养鸭业[6-7]。 DTMUV归属于黄病毒科（Flaviviridae）、黄病毒属（Flavivirus）。 病毒为单股正链RNA、大小为10.9 kb，粒子的直径大小为30～60 nm[8-9]。DTMUV囊膜蛋白E蛋白由3个结构域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）组成，是最主要的抗原结构，是使病毒与受体结合进入细胞的重要蛋白[10]。结构域Ⅰ为中心结构域，具有影响血清学或生物活性的表位,结构域Ⅱ包含中和作用和血凝活性的表位,结构域Ⅲ参与受体结合作用[11-13]。1955—2017年间分离的DTMUVE基因发生了较大的突变，表明DTMUV正在快速进化，可能导致病毒变异体出现[11]。

目前，中国已经研制出商品灭活疫苗和弱毒活疫苗，但由于疫苗未完全普及或免疫失败，近年来在一些养鸭场仍然有鸭坦布苏病毒病的发生[14]。现有的DTMUV商品疫苗已减轻了疾病的流行，但RNA病毒遗传变异几率较大，可导致病毒毒力升高，使现有疫苗保护效力降低引发更严重的损失[15-16]。黄病毒属的其他病毒，如西尼罗河病毒、登革病毒、日本脑炎病毒和黄热病病毒等都是人畜共患病病原体，虽然目前没有DTMUV病原感染人类的病例，但有研究报导鸭场工作人员检出DTMUV阳性抗体[17]；DTMUV不仅能感染小鼠，而且在BHK-21、Vero、293T等哺乳动物细胞系中增殖能力很强，人神经细胞系和肝细胞系均具有高度易感性，说明DTMUV是一种潜在的人畜共患病原体，可能对公众安全构成潜在威胁[18-21]。因此，掌握DTMUV病原特性、流行规律和遗传进化规律等对该病的监测、防控以及公共安全十分重要[21-22]。为了掌握鸭坦布苏病毒病的流行规律和病原特征，本研究通过分离河北某鸭场发病鸭病料的病原，通过RT-PCR、透射电镜、Western blotting及间接免疫荧光试验（IFA）进行鉴定，并对分离毒株进行囊膜蛋白测序和遗传进化分析，以便确定病毒来源及其进化规律，为进一步开展针对DTMUV变异毒株的疫苗研发及其防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

20只30日龄北京鸭购自北京南口北京鸭育种中心，DTMUV抗原、抗体检测均为阴性；病料来自河北省某鸭场疑似DTMUV感染的鸭，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所保存；SPF鸡胚购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司；鸡胚成纤维细胞（DF-1）由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所兽医公共卫生实验室保存。

病毒RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自Axygen公司；Prime STAR®Max DNA聚合酶、反转录试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；DTMUV E蛋白单克隆抗体由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所兽医公共卫生实验室保存；HRP标记山羊抗鼠Ig（H+L）购自碧云天生物技术有限公司；山羊抗小鼠IgG H&L（FITC）购自艾博抗（上海）贸易有限公司；DMEM培养基、胎牛血清购自宝林科（北京）生物科技有限公司。透射电子显微镜（HT770）购自日立（中国）有限公司；激光共聚焦显微镜系统（TCS SP8）购自徕莱卡微系统股份公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank中DTMUV全基因序列（登录号：MN649262.1），选择保守片段用Primer Premier 5软件分别设计2对引物，引物P1用于临床样品的病原鉴定；引物P2用于扩增E基因全长，进行病毒的遗传进化树分析，引物序列见表1。引物均由金唯智生物科技（北京）有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.2 病毒PCR检测 采集10只发病鸭的肝脏、脾脏和脑用于病毒分离。将肝脏、脾脏、脑组织1∶4加入生理盐水研磨形成混悬液，-80 ℃反复冻融3次，8 000×g离心30 min取上清进行PCR鉴定。根据病毒RNA提取试剂盒说明书提取病料上清液RNA，反转录合成cDNA。 PCR体系50 μL：PrimerSTAR Max DNA聚合酶25 μL，上、下游引物（10 mmol/L）各1 μL，cDNA模板3 μL,ddH2O补至50 μL。PCR扩增条件：98 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，53 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.2.3 病毒分离与E基因鉴定 分别采用DF-1细胞和9日龄SPF鸡胚进行病毒分离。将过滤后的病毒液接种到单层DF-1细胞上，每12 h观察细胞病变效应（CPE），待CPE达80%时收获病毒，反复冻融3次，连续盲传5代，-80 ℃保存备用；将过滤后的病毒液接种9日龄SPF鸡胚尿囊腔（0.2 mL/枚），弃掉24 h内死亡鸡胚，收集24～120 h内死亡鸡胚尿囊液，并解剖观察死亡鸡胚。将病毒在SPF鸡胚上连续传至第5代，收集死亡鸡胚尿囊液储存至-80 ℃保存备用。对收集的第5代尿囊液进行血凝（HA）试验，测定分离株对鸡红细胞的凝集特性，具体操作参照《中华人民共和国兽药典》。为了进一步鉴定分离到的毒株，用RNA提取试剂盒提取第5代鸡胚尿囊液RNA，用P2引物扩增E基因全长，PCR体系及程序同1.2.2。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.2.4 病毒纯化及电镜观察 收集鸡胚尿囊液，4 ℃、8 000×g离心30 min，上清用0.22 μm滤膜过滤除去杂质后加入8% PEG6000磁力搅拌器搅拌过夜，9 000×g离心1 h，将沉淀用1 mL PBS重悬，20%蔗糖35 000×g离心2 h后再次重悬沉淀，25%、45%不连续蔗糖梯度35 000×g离心1.5 h，从灰色界面处取500 μL，3%磷钨酸负染后在透射电镜下观察。

1.2.5 病毒Western blotting鉴定 将纯化后的病毒接种于生长状态良好的DF-1细胞上，36 h后收取样品全蛋白进行12% SDS-PAGE，转印到NC膜上，用5% BSA 4 ℃封闭过夜，TBST清洗5遍，DTMUV一抗（1∶500） 4 ℃孵育过夜，TBST清洗5遍，HRP标记的羊抗鼠IgG（1∶1 000）室温孵育1 h，TBST清洗5遍，通过ELC显色观察。

1.2.6 病毒IFA鉴定 将纯化后的病毒接种于单层DF-1细胞上，待细胞出现明显CPE，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS洗5遍，1% Triton X-100通透15 min，PBS洗5遍，加入DTMUV一抗（1∶2 000），4 ℃孵育过夜，PBS洗5遍，再加入FITC标记的羊抗鼠IgG（1∶1 000）室温孵育1 h，PBS洗5遍，最后用抗荧光衰减封片剂（含DAPI）封片，用激光共聚焦荧光显微镜观察。未接种病毒的DF-1细胞作为阴性对照。

1.2.7 动物回归试验 将20只30日龄健康雏鸭分为2组，试验组腿部肌内注射纯化后的病毒1 mL，对照组接种1 mL PBS，记录10 d内各组临床症状及发病、死亡情况，接种后第10天处死，剖检并观察其心脏、肝脏和脾脏等的病理变化。

1.3 病毒囊膜蛋白序列分析

用胶回收试剂盒对从鸡尿囊液中扩增出的E基因PCR产物进行回收，连接pESAY-Blunt克隆载体，并按说明书进行转化扩增，将鉴定为阳性的质粒送于北京擎科生物科技有限公司测序。 利用Mega 6.0对E基因序列与GenBank中已发表的其他DTMUVE基因序列进行遗传进化分析和相似性比对。 同时比对分离株与商品灭活疫苗HB2010株（MN649262.1）、活疫苗FX2010（MH414568.1）和WFZ株（KC990545.1）的氨基酸序列并进行分析。

2 结 果

2.1 病毒分离及鉴定

2.1.1 病毒PCR检测 对病料上清液进行PCR鉴定，PCR产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳后，在约270 bp处可见单一条带（图1），与预期大小一致。

M，DL2000 DNA Marker;1，阳性对照；2，阴性对照；3，病料上清液M，DL2000 DNA Marker；1，Positive control;2，Negative control；3，Supernatant of diseased material图1 病毒PCR检测结果Fig.1 PCR detection results of virus

2.1.2 病毒分离和病变观察 将过滤除菌后的DTMUV阳性组织上清液用DF-1细胞和9日龄SPF鸡胚进行分离培养。 接种DF-1细胞后，在接种48 h即出现CPE，接种48 h后细胞变圆脱落，折光性增强（图2）。病毒在DF1细胞上稳定增殖，可连续传至5代。鸡胚接种病毒液72～96 h出现死亡，死亡鸡胚胚体发育不良、有出血斑，剖检可见肝脏发黄并有出血点（图3）。

A，正常DF-1细胞；B，病毒感染的DF-1细胞A，Normal DF-1 cells；B，DF-1 cells infected by virus图2 病毒感染后DF-1细胞的病变情况（100×）Fig.2 The pathological changes of DF-1 cells after virus infection （100×）

1、2，正常鸡胚；3～7，病毒感染鸡胚1 and 2，Normal chicken embryos；3-7，Chicken embryos infected by virus图3 病毒感染后鸡胚病变情况Fig.3 Pathological changes of chicken embryos after virus infection

2.1.3 病毒HA及E基因鉴定 HA检测结果表明，病毒对鸡红细胞无血凝活性。对第5代鸡胚尿囊液进行PCR鉴定，结果显示，在约1 517 bp可见与预期大小一致的单一E基因条带（图4），提示成功分离病毒，并命名为AX2020株。

M，DL2000 DNA Marker；1，阳性对照；2，阴性对照；3，尿囊液M,DL2000 DNA Marker;1,Positive control;2,Negative control;3,Allantotic fluid图4 病毒E基因PCR检测结果Fig.4 PCR detection results of E gene of virus

2.2 病毒纯化及电镜观察

经超速离心后，在25%、45%不连续蔗糖梯度间可见灰色病毒带，将其取出用3%磷钨酸负染后，经透射电镜观察可见球型的病毒粒子，直径大小为30～60 nm，与DTMUV粒子形态一致（图5）。

图5 AX2020株电镜观察结果（98 000×）Fig.5 Electron microscopic observation of AX2020 strain （98 000×）

2.3 病毒Western blotting及IFA鉴定结果

用DTMUV E蛋白单克隆抗体孵育后，经Western blotting鉴定，发现60 ku处有特异性条带（图6），与E蛋白大小一致，说明DTMUV分离株AX2020感染DF-1细胞后，能够正常合成E蛋白。IFA鉴定结果表明，接种了病毒的DF-1细胞其胞质中可见明亮的特异性荧光（绿色荧光信号），而未接种病毒的DF-1细胞无特异荧光（图7），说明病毒感染DF-1细胞后能够表达相关蛋白。

图6 AX2020株Western blotting结果Fig.6 Western blotting results of AX2020 strain

图7 AX2020株IFA鉴定（200×）Fig.7 Identification of AX2020 strain by IFA （200×）

2.4 动物回归试验结果

将第5代纯化后的病毒肌内注射30日龄健康的北京鸭，接种后3 d眼角出现泪痕，精神不振，食欲下降，6 d排褐色稀便，出现站立不稳、瘫痪、共济失调等神经症状，第8天死亡1只。剖检死亡鸭可见脑膜有出血，心脏肿大淤血,心包积液，肝脏肿大淤血、表面有弥散性大小不一的出血点，脾脏肿大呈大理石样，肺脏出血，胰腺出血，对照组无明显变化（图8）。试验组发病率为100%，死亡率为10%。

图8 组织病理结果Fig.8 Histopathological results

2.5 囊膜蛋白序列分析结果

利用Mega 6.0将本研究分离的AX2020株与GenBank中其他已发表的黄病毒属的毒株进行囊膜蛋白的遗传进化分析，结果表明，DTMUVE基因核苷酸系统进化树分为2支，AX2020株与GA株（MK907880.1）相似性达99.1%，亲缘关系最近，并与HB2010株（MN649262.1）在同一进化分支上（图9）。序列比对发现，AX2020株与纳米比亚的巴格扎病毒（MW672101.1）核苷酸相似性最近，为72.6%，与印度尼西亚的登革病毒（AY858036.2）核苷酸相似性为58.1%;AX2020分离株与商品灭活疫苗HB2010株和活疫苗FX2010相比，与商品灭活疫苗HB2010株核苷酸相似性为97.4%，而与活疫苗FX2010株相比核苷酸相似性略低，为97.3%（表2）。E蛋白氨基酸相似性比对结果显示，AX2020株与其他DTMUV参考株相似性为95.0%～99.8%（表2）。与HB2010和FX2010株相比，AX2020株第93位氨基酸由K变为R，第277位由S变为N,第487位由A变为V，此外与活疫苗FX2010株相比，第38位由K变为R；与WFZ_2012株（KC990545.1）相比，AX2020株E蛋白的156位为由P变为S（表3）。

图9 DTMUV E基因核苷酸进化树Fig.9 Phylogenetic tree of DTMUV E gene nucleotide

表2 E基因核苷酸和氨基酸相似性比对Table 2 Similarity comparison of nucleotides and amino acids of E gene

续表

表3 DTMUV分离株氨基酸突变位点Table 3 Amino acid mutation sites of DTMUV isolate

3 讨 论

鸭坦布苏病毒病严重威胁着中国养鸭业的发展，在中国东南沿海主要鸭养殖地区均有该病的发生与流行，感染鸭的体重和产蛋量大幅下降，卵巢萎缩出血，发病率极高[22]。因此了解DTMUV的病原学和流行病学对控制该病发生非常重要。通过RT-PCR、透射电镜、Western blotting及IFA进行鉴定，并对分离毒株进行了囊膜蛋白测序和遗传进化分析，以了解其病原学特性及其进化规律。在病毒的分离试验中，最先采用Vero细胞进行分离培养发现，该毒株在Vero细胞上适应3代以上才能产生CPE，这可能会导致病毒毒力减弱或基因组的突变。鉴于此，尝试采用DF-1细胞进行分离培养，结果发现，接种后48 h即可观察到明显CPE，建立了DTMUV低代次分离培养的方法，为其病原学特性评价和遗传进化分析奠定了基础。电镜下观察到DTMUV粒子直径与早期报道之间略有不同，Su等[6]和Yan等[7]从受感染的DEF细胞的超薄切片中测得病毒粒子直径为30～45 nm。本试验观察到的病毒粒子直径为30～60 nm，且大小不均一,可能是由于标本处理方法不同，通过3%磷钨酸负染观察到的病毒呈真实大小，而超薄切片尤其是在包埋时会导致细胞收缩，使观察到的病毒粒子变小；黄病毒成熟病毒粒子与未成熟病毒粒子相比直径较小，本试验采用鸡胚培养病毒时冻融尿囊液会把细胞中不成熟病毒粒子释放出来，导致病毒粒子大小不均一[23]。动物回归试验显示，攻毒鸭全部感染，死亡率达到10%，感染鸭出现的症状与DTMUV典型症状基本一致[24]，说明AX2020株为高致病性毒株。遗传进化分析结果显示，分离株E蛋白核苷酸序列与其他鸭源毒株相似性较高（89.2%～99.1%），与鹅源、鸡源TMUV相似性分别为96.4%、97.3%，说明该病毒与鹅源、鸡源TMUV在病毒起源和进化上存在紧密关联。AX2020分离株与泰国DKTHCU-1株（KR061333.1）在同一进化分支上，表明分离株可能与泰国病毒的传播紧密相关。 这表明DTMUV在遗传上具有一定的差异性,引起差异性的原因可能是由于不同地区的DTMUV在进化过程中逐渐变异。

DTMUV囊膜蛋白E蛋白是最主要的抗原结构，含有多种抗原表位来识别受体，在病毒入侵时诱发机体产生中和性抗体，是研制疫苗时的靶蛋白[25]，黄病毒属的乙型脑炎病毒E蛋白氨基酸的突变可影响病毒的毒力及神经侵袭力[26]。 对DTMUVE基因序列分析显示，AX2020分离株与商品灭活疫苗HB2010株和活疫苗FX2010相比，结构域Ⅱ的第93位氨基酸由K变为R，第277位由S变为N，这2个位点的突变可能会导致分离株中和作用和血凝活性的改变，结构域外第487位由A变为V。此外，与活疫苗FX2010株相比，结构域Ⅰ的第38位由K变为R，可能会影响分离株的血清学和生物活性。与WFZ_2012株相比，DTMUV分离株E蛋白的156位由P变为S，可使病毒更加高效地复制和传播[13]。这些氨基酸的突变可能影响DTMUV的抗原性，导致现有疫苗的免疫保护不完全并引起新的流行。因此，应持续加强DTMUV在生产中的流行病学监测和遗传变异情况分析，同时采取加强生物安全管理、研发新型疫苗等措施，控制该病的传播和流行，保障中国鸭养殖业的健康持续发展。

4 结 论

本研究成功分离得到1株具有DTMUV分子特征的毒株AX2020株，可在DF-1细胞上稳定增殖产生典型CPE并致死鸡胚，感染雏鸭后产生典型的DTMUV感染症状。AX2020株囊膜蛋白与国内现有疫苗株相比第93、277、487位氨基酸发生了突变，本研究结果为进一步开展针对DTMUV变异毒株的疫苗及其防控研究奠定了基础。