拉曼光谱结合支持向量机对猪胞质内单精子显微注射胚胎性别的鉴定分析

2022-06-01孙俊丽孙如玉廖海洪卢健琴卢晟盛

中国畜牧兽医 2022年4期

孙俊丽，孙如玉，廖海洪，卢健琴，严静，卢晟盛,张冰

（1.广西畜牧研究所，家畜遗传改良重点实验室，南宁 530001；2.广西大学农牧产业发展研究院，南宁 530004）

性别控制技术是胚胎工程中的一项重要技术，可以根据需求有目的的生产公畜或者母畜，从而增加选种强度，加快遗传进展和育种进程，也可充分发挥受性别限制的生产性状（如泌乳）和受性别影响的生产性状（如生长速度、肉质等）的最大经济效益，对于畜牧业的品种选育、品种保护和优良种群扩繁等都有着重要的意义。目前，可在生产中应用的性别控制技术主要有两种：①基于X、Y精子DNA含量差异的流式细胞分离技术，但是精子的流式细胞分选需要高倍稀释、染色、高压、激光照射、高速离心及冷冻解冻等处理，产生活性氧会引起氧化应激，对精子细胞器、膜磷脂、DNA等造成一定程度的损伤，造成受精率下降，且成本较高等[1]；②基于Y染色体上特有基因（睾丸决定因子SRY基因、Y染色体重复序列）或者X/Y性染色体上的差异基因（牙釉质基因、锌指蛋白基因、染色体螺旋蛋白基因等）的PCR扩增来鉴定胚胎性别，然后通过胚胎移植等技术生产所需性别的后代，但是该方法需要采集样本，易引起胚胎污染，造成胚胎损伤而死亡，且对操作人员的技术要求高。因此，探求一种非侵入性的、无损的、快速的性别鉴定技术非常必要。

拉曼光谱技术是由印度科学家拉曼（Raman）于1928年提出的,他认为不同的样品接受激光照射后，会产生不同的拉曼光谱位移和谱带强度。因此通过检测样品的拉曼散射并绘制成光谱，然后分析拉曼光谱的峰位信息，便可进行样品鉴定[2]。黄静等[3]利用拉曼光谱技术对人胞质内单精子显微注射（ICSI）胚胎培养液进行分析，结果发现优质胚胎与非优质胚胎的拉曼光谱明显不同，采用拉曼光谱结合卷积神经网络模型（CNN）算法，可以区分优质胚胎与非优质胚胎。徐维海等[4]通过对人胚胎培养液的拉曼光谱分析来优选具有发育潜力的胚胎，结果获得了清晰、真实、可比性好的拉曼光谱模型，筛选的潜力胚胎与囊胚形成呈中度一致。Ding等[5]利用拉曼光谱技术对人胚胎培养液的研究发现，在鉴定人的胚胎质量时，拉曼光谱技术与传统的形态学评分方法得到的结果是一致的。以上研究表明，拉曼光谱技术可以作为一种非侵入性、无损的代谢组学分析技术对胚胎培养液进行研究，且操作方便，实用性强。

前人研究发现，雌、雄早期胚胎在发育速度、吸收代谢、遗传学和表观遗传学等许多方面存在明显差异[6-8]。胚胎培养液作为体外胚胎发育的微环境，既给胚胎提供营养物质，又容纳着胚胎的代谢产物，因而雌、雄胚胎的培养液也存在差异，受到激光照射后会产生不同的拉曼光谱位移和谱带强度，据此推断可以利用拉曼光谱技术对胚胎的性别进行鉴定分析。目前，这方面的报道还鲜有见到。因此，本研究利用拉曼光谱技术对猪胚胎代谢液进行分析并构建判别模型，预测胚胎性别，以期寻找一种快速无损的早期胚胎性别鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 材料

猪卵巢取自广西南宁市石埠屠宰场，采样后置于34～37 ℃含双抗的生理盐水中，3 h内运回实验室。

1.2 主要试剂和仪器

TCM-199、0.25%胰酶均购自Gibco公司；胎牛血清购自HyClone公司；卵泡刺激素（FSH）、促黄体生成素（LH）和表皮细胞生长因子（EGF）均购自中国科学院动物研究所；2×TaqPCR Master Mix和蛋白酶K均购自天根生化科技（北京）有限公司；卵泡液（PFF）自制；其余主要试剂均购自Sigma公司。

CO2培养箱（LS-CO 150）购自Thermo公司；显微操作仪（NT-88-V3）和体视显微镜（SMZ 745）均购自Nikon公司；细胞融合仪（ECM 2001）购自BTX公司；梯度PCR仪（T GRADIENT）购自Biometra公司；拉曼光谱仪由广西科学院自主搭建（主要配置：尼康TE2000倒置显微镜、Tiger激光器、Spec-10 CCD等）。

1.3 方法

1.3.1 猪卵母细胞的收集和成熟培养剪掉卵巢周围系膜、系带，用37 ℃生理盐水洗涤3次，去除血水和污物，移至层流室，置于37 ℃水浴锅保温。用一次性注射器抽吸直径3～6 mm的卵泡，卵泡液置于离心管中沉淀15～20 min。去掉上清，沉淀放于有洗卵液的平皿，体视显微镜下挑取颗粒层细胞在3层以上的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。然后将COCs在预平衡的卵母细胞成熟液（含有0.01 μg/ mL EGF、0.5 μg/mL FSH、0.5 μg/mL LH和10% PFF）中洗3遍后，转入成熟液滴中，38.5 ℃、5% CO2和100%湿度条件下培养20～22 h 后，转移至不含FSH和LH的成熟液滴中继续培养。COCs成熟40～42 h，转移到2 mL含0.2%透明质酸酶的洗卵液中静置消化1 min，然后轻柔吹吸至卵丘细胞完全脱落。将卵母细胞移至干净的洗卵液中清洗3次，体视显微镜下挑选胞质均匀、卵周隙清晰、极体完整圆润、折光度好的卵母细胞。

1.3.2 精子的清洗取200 μL猪鲜精加入2 mL的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS），1 000 r/min离心5 min,重复3次。然后加入1 mL DPBS溶液，置于超声波细胞粉碎机进行断尾处理，1 000 r/min离心2 min。去掉上清，将离心好的精子稀释到106/mL备用[9]。

1.3.3 ICSI 用显微操作液、0.25%胰酶液和7%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）液制作显微操作盘，矿物油封顶。吸取10 μL精液放入PVP液中，卵母细胞放入操作液中。从PVP液中吸取一个精子移入卵母细胞液，用固定针吸住卵母细胞，然后用注射针拨动卵母细胞，使极体位于12点或者6点方向，从3点的位置穿过透明带和细胞膜，将精子注入卵胞质。随后撤出显微注射针，并释放卵母细胞。

1.3.4 ICSI胚胎的化学激活和培养先将ICSI胚胎在洗卵液中清洗2遍，转移到平衡好的猪胚胎培养液（porcine zygote medium-3，PZM-3）滴中，恢复约1 h。然后移入5 μL/L的离子霉素（ionomycin）液中处理3.5 min，再转入平衡好的2.5 mmol/L 6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）液中，培养3.5 h。然后移入平衡好的PZM-3溶液中清洗2遍，再转入PZM-3培养液滴中，每滴15～20枚胚胎，38.5 ℃、5% CO2和100%湿度条件下继续培养。

1.3.5 单胚胎培养和培养液的收集胚胎培养至第5天，将发育至早期囊胚的胚胎移入平衡好的20 μL PZM-3小滴，每滴1枚胚胎，培养4 h。然后用20 μL移液枪小心吸取培养液至200 μL EP管，并收集对应的囊胚，用ddH2O清洗2次后放入0.2 mL的EP管，做好标记。收集同批次空白胚胎培养微滴作为对照组。收集的培养液放入-80 ℃、胚胎放入-20 ℃保存备用。

1.3.6 巢式PCR鉴定囊胚性别基于猪AMELx、AMELy基因内含子3中9～10 bp的序列缺失[10]，本研究利用巢式PCR对猪单个囊胚的性别进行判定。根据猪AMEL基因内含子3序列（AMELx，GenBank 登录号：AB091791；AMELy，GenBank登录号：AB091792）设计巢式PCR引物。外引物：AMEL-Fo:5′-AAGCTACCACCTCATC-CTG-3′，AMEL-Ro:5′-GCCATCTCATACTTTC-CCTTG-3′。内引物：AMEL-Fi:5′-GGTGGATTC-TTCATTCAGGATG-3′，AMEL-Ri:5′-AAAGA-CCAGCGAGGGAGA-3′。在内引物Fi的5′端添加6-FAM荧光，用于PCR产物扫描分型，引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成。单囊胚巢氏PCR具体步骤参见孙俊丽等[11]的研究。扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，送往Thermofisher Scientific公司进行片段大小扫描。根据基因片段扫描主峰的多少来判定胚胎性别：雌性胚胎只有AMELx等位基因，在178-179 bp处出现1个主峰；而雄性胚胎含有AMELx和AMELy2个等位基因，在169-171 bp和178-179 bp处出现2个主峰。

1.3.7 拉曼光谱的收集拉曼光谱数据收集的方法参照姚辉璐等[12]的方法。样品池由厚4 mm的载玻片中间挖1个直径为6 mm的孔，孔底用1个厚100 μm石英片密封而成。取20 μL解冻的单胚胎培养液放于样品池上，然后将样品池小心放置在滴有石英油的物镜上，经半导体激光器产生波长为785 nm的光束导入倒置显微镜，用100倍（N.A.1.25）油浸物镜观察聚焦测量点，采样输出功率20 mW，积分时间设为100 s，每个样品采集3次。用同样的激发功率和积分时间采集空白对照光谱。用培养液的拉曼光谱减去该批次的空白对照光谱，即得到单胚胎培养液的拉曼光谱。

1.3.8 拉曼光谱数据处理在采集拉曼光谱时存在着诸多干扰源，干扰信号会掩盖样品光谱中的有用信息，影响光谱有效信息提取、建模以及预测效果。先采用高国明等[13]的极小极大值自适应缩放法对原始光谱进行预处理，去除荧光背景和噪声，提高信噪比；再利用Origin 8.0软件对预处理后的拉曼光谱去除头尾中的一部分不准确数据，留取600-1 800 cm-1区域内的光谱信号。使用Matlab 2018软件中的Libsvm程序包对拉曼数据进行主成分分析（PCA），提取样品特征变量，降低数据维度，然后采用支持向量机（support vector machine，SVM）法建立分类判别模型。随机选取样本组成训练集和测试集，先将训练样本放入SVM算法中进行训练和建模，然后将测试样本输入算法中预测样本的性别，最后利用PCR鉴定结果计算预测结果的准确率。

2 结果

2.1 巢式PCR鉴定囊胚性别

巢式PCR扩增结果显示，外引物扩增片段长度约为530 bp，内引物扩增片段长度约为170 bp（图1），与预期结果相同。本试验收集了207个猪ICSI早期囊胚，通过巢式PCR成功获得了199个样品的目的片段，8个样品扩增失败。然后进行荧光标记-半自动基因扫描（图2），结果发现71个是雄性胚胎，128个是雌性胚胎。

1～10，外引物扩增结果；M1，DL2000 DNA Marker；M2，DL1000 DNA Marker；1′～10′，内引物扩增结果1-10，Amplification results of outer primers;M1，DL2000 DNA Marker；M2，DL1000 DNA Marker；1′-10′，Amplification results of inner primers图1 猪AMEL基因内、外引物的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of inner and outer primers of AMEL gene in porcine

单峰,雌性;双峰,雄性Single peak,Female;Double peaks,Male图2 扩增产物的基因片段扫描Fig.2 Gene fragment scanning of amplified products

2.2 不同性别猪ICSI胚胎培养液拉曼光谱的比较

按照拉曼光谱采集方法获取ICSI胚胎培养液的拉曼光谱，根据巢式PCR判定结果，将拉曼光谱数据分为XX（雌性）和XY（雄性）2组，分别计算2组拉曼数据的平均光谱（图3）。然后将XY（雄性）组的平均光谱减去XX（雌性）组的平均光谱，获得差异光谱（图4）。由图4可知，猪ICSI雄性胚胎培养液在1 082和1 360 cm-1拉曼位移处的特征峰强度明显高于雌性胚胎的。

图3 猪ICSI囊胚培养液原始拉曼光谱图（A）和平均拉曼光谱图（B）Fig.3 Primitive Raman spectra （A） and average Raman spectra （B） of cultured medium of porcine ICSI blastocysts

图4 猪雌雄ICSI囊胚培养液的平均拉曼光谱图Fig.4 Average Raman spectra on cultured medium of porcine female and male ICSI blastocysts

2.3 SVM法构建胚胎性别分类判别模型

随机选取经巢式PCR鉴定的112个雌性和60个雄性胚胎培养液的拉曼光谱进入训练集进行建模，用Matlab软件对拉曼光谱进行主成分分析（PCA），获取累计贡献率达到90%以上的特征变量，以确保建模结果的可靠性，选择高斯核函数进行SVM算法的分类建模。结果发现，该模型对训练集样品分类的准确率达92.0%，雌性灵敏度89.7%，雄性灵敏度96.0%。然后利用该模型对27个测试集（雄性胚胎培养液16份、雌性胚胎培养液11份）中的样品进行分类预测，并与PCR性别鉴定结果对比发现，11个雄性胚胎中有2个被错判为雌性胚胎，其准确率为81.8%；16个雌性胚胎中有3个被错判为雄性胚胎，其准确率为81.3%；总准确率为81.5%（表1）。

表1 SVM模型对胚胎性别预测结果Table 1 Prediction results of embryos gender by SVM model

3 讨论

光谱分析技术是基于物质分子的振动变化来分析物质结构和组成的方法，其中红外光谱技术和拉曼光谱技术已被广泛应用于生命科学研究领域，特别是在代谢组学研究方面展现了其独特的优势。早在2007年，Seli等[14]利用拉曼光谱和近红外光谱技术分析了人体外受精（IVF）第3天胚胎的培养液，并预测胚胎发育潜能，发现拉曼光谱技术预测的灵敏度和特异性分别为86%和76.5%，红外光谱技术预测的分别为75%和83.3%。2008年也发表了3篇类似的报道[15-17]，发现基于胚胎代谢液的拉曼光谱预测人胚胎发育潜能的灵敏度和特异性最高分别达到100%和90%。所以作者认为基于培养液的代谢组学光谱分析技术可作为胚胎移植前的一种快速、无损的胚胎发育潜能评估方法。2013年，Zhao等[18]利用拉曼光谱技术分析人胚胎培养液时发现，培养液中含有相对浓度低于0.012的丙酮酸钠和高于-0.00085的苯基丙氨酸的胚胎具有更好的发育潜能，分类准确率为85.7%。2015年，Santos等[19]利用拉曼光谱技术对牛体外胚胎培养液的代谢组学进行了分析，发现有无胚胎的培养液的拉曼光谱间存在明显差异。随后基于拉曼光谱和红外光谱技术分析胚胎培养液、卵母细胞培养液的研究陆续报道，认为光谱技术可以作为一种非侵入性、无损的、微量的代谢组学分析技术，具有很强的实用性[5,20]。

在胚胎早期发育过程中，性别差异基因的不同表达会影响表观调控和代谢应答，因而可能会导致不同物种间的早期胚胎发育代谢存在差异，不同性别间的早期胚胎代谢液也会出现差异。Gardner等[21]提出，利用蛋白质组学和代谢组学对胚胎培养液进行分析来鉴定胚胎性别。随后，Gardner等[22]通过对胚胎培养液中葡萄糖消耗的研究，对人胚胎性别进行了鉴定。Gerald等[23]利用红外光谱成像技术鉴定受精未孵化鸡蛋的性别，结果发现雄性胚盘细胞中DNA含量高于雌性，其鉴定结果与PCR鉴定结果一致。Munoz等[24]利用傅里叶红外光谱技术通过对牛胚胎培养液的代谢组学分析来鉴定胚胎性别，扩张囊胚的准确率为86%，早期囊胚准确率为74.9%。目前，基于胚胎培养液的光谱技术来鉴定胚胎性别方面的研究主要是利用红外光谱技术，利用拉曼光谱技术的还少有报道。随着拉曼光谱技术的快速发展，利用拉曼光谱来分析代谢液或者培养液比红外光谱效果更好：①拉曼光谱对组织或生物样品中微小的生化和分子变化很敏感[25]；②水在生命体系中是重要的介质，而水的拉曼光谱较弱，特征简单[26]，相比红外光谱技术更有利于对溶液类样品的分析检测；③拉曼光谱分析无需对样品进行标记；④拉曼光谱分析对样品的需要量少（仅几微升），几乎不需要前处理[18]；⑤拉曼光谱技术操作简单，检测时间短。本研究是以单个早期囊胚短时间内的培养液为研究对象，样品量少、胚胎代谢物质微量，且水为主要组分，因此选择拉曼光谱技术采集猪早期囊胚培养液的光谱图，然后用SVM法构建分类判别模型，用于样本的训练和预测。结果发现，不同性别猪胚胎培养液在1 082和1 360 cm-1特征峰强度存在明显差异，且雄性胚胎的峰值明显高于雌性胚胎的。对照拉曼特征峰物质归属表发现，1 082 cm-1归属DNA对称磷酸离子O-P-O-伸缩振动，该特征峰强度的改变预示DNA发生单、双链的断裂[27]，1 360 cm-1归属N-乙酰基葡萄糖的CH3弯曲振动[28]。确定猪ICSI雄性和雌性胚胎培养液的拉曼光谱间存在明显不同，依此利用SVM法构建猪ICSI早期囊胚性别分类判别模型，其雄性胚胎的分类准确率为81.8%，雌性胚胎的分类准确率为81.3%，总分类准确率为81.5%，高于红外光谱技术鉴定牛早期囊胚的准确率（74.9%）[24]，低于红外光谱技术鉴定扩张囊胚的准确率（86%）[24]。扩张囊胚时期的分类准确率高于早期囊胚的，原因可能是扩张囊胚时期的代谢更为旺盛，性别间的代谢差异更大，因而性别鉴定的分类准确率较高。

本研究的分类准确率不是很理想，分析有以下几点原因：①原始拉曼光谱的预处理方面。实测的拉曼光谱中存在着诸多干扰源，如激光及拉曼散射光的发射噪声、CCD探测器的各种噪声、样品及样品容器的荧光背景等，这些干扰信号会淹没样品的光谱信息，影响光谱有效信息获得和模型建立及其效果预测。为了消除干扰因素的影响，通过查阅文献，选择了与本研究对象相近案例的预处理方法，即采用高国明等[13]的极小极大值自适应缩放法进行预处理，而没有开发针对本研究的拉曼光谱的预处理方法，有可能会造成其他有用信号的丢失，进而影响分类模型的构建和预测。②建模算法及其参数的选择方面。本研究利用拉曼光谱技术采集猪胚胎培养液的光谱图并进行分析，然后用SVM法构建分类判别模型，用于样本的训练和预测。拉曼光谱的原始数据过多，如果全部用于SVM建模，数据计算难度太大，模型也过于复杂。为了降低数据计算难度和模型复杂度，先用PCA对原始数据进行降维；同时为了提高分类准确率，选择累计贡献率达到90%以上的维数。在用SVM法构建分类判别模型时，首先要选择合适的核函数。高斯核函数性能优异并且稳定，不但收敛域较宽，而且能够适用于很多不同特征的样本，其参数也相对简单，因而选择高斯核函数进行分类。高斯核函数需要的惩罚因子和核函数的宽度等参数，使用Matlab软件进行参数优化。SVM算法所用的参数主要是利用Matlab软件自行优化，针对性的调整优化可能做得不好，故而导致分类准确率不高。③构建模型的样本量小，可能造成抽样误差，需要增加样本量来提高准确率。因此，需要进一步深入的研究来完善优化上述问题，从而建立一种无损的胚胎性别鉴定方法，这对畜牧业的体外胚胎生产和人类的辅助生殖等方面具有重要的科学研究价值和广阔的应用前景。