F3代波杂山羊VNN1基因多态性及其与产羔数的关联分析

阮 涌，陈 祥，代林刚，黄家锦，安冬伟，邹启顺

（1.贵州大学，高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵阳 550025；2.贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵阳 550025；3.贵州大学动物科学学院，贵阳 550025；4.务川自治县宏牧羊业有限公司，铜仁 564300）

泛酰巯基乙胺酶（pantetheinase）是一类泛酰巯基乙胺水解酶，能水解泛酞琉基乙胺形成泛酸和半胱胺[1]。泛酞琉基乙胺酶在马、牛、猪、大鼠、奶牛、鸽子和鸡的肝脏、肾脏、心脏和肌肉组织中均有发现[2-3]。 Vanin是泛酰巯基乙胺水解酶的一种，Vanin家族包括VNN1、VNN2和VNN3，其中VNN1在Vanin家族中研究最多[4]。 VNN1在糖脂代谢、免疫、肿瘤形成等生命过程中发挥着十分重要的作用[5]。1996年，VNN1蛋白首次在小鼠中被鉴定，是由血管周围的胸腺基质细胞表达的分子质量为70 ku的糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定分子，参与调节胸腺归巢中的细胞黏附[6]。 1999年，Maras等[7]从猪肾脏中分离出泛酰巯基乙胺酶，其部分氨基酸序列与人和小鼠VNN1基因的相似性分别为83.2%和79.7%，因此认为VNNl可能具有泛酰巯基乙胺酶活性。

目前不仅在果蝇中发现VNN1基因[8-9]，Caldwell等[10]发现VNN1基因在鸡中同样存在，野生型小鼠血清中可以检测到Vanin-1，小鼠VNN1在肝脏、肾脏、卵巢、肠及上皮细胞中均有表达，肝脏中的VNN1主要由肝小叶中心区的细胞表达，肝脏释放的VNN1能到达血清中，肝脏和血清中的VNN1均具有泛酰巯基乙胺酶活性，且这种活性可以被VNN1基因突变所抑制[11]。Pitari等[12]研究发现，VNN1基因转染的小鼠表皮细胞膜上有VNN1蛋白的表达，且细胞具有泛酰巯基乙胺酶活性；而VNN1基因敲低的小鼠失去了泛酰巯基乙胺酶活性，且检测不到游离的巯基乙胺。Chen等[13]研究发现，VNN1在禁食小鼠或胰岛素抵抗小鼠的肝脏中表达被诱导，其中VNN1增加了糖异生基因的表达和肝脏葡萄糖输出，从而导致高血糖，主要通过调控Akt信号通路介导。因此，VNN1可能成为治疗过度激活糖异生引起的代谢性疾病的潜在靶点。Holleboom等[14]研究发现，VNN1在小鼠高密度脂蛋白（HDL）代谢中发挥着重要的作用。对墨西哥儿童脂质性状研究显示，VNN1基因G137T的多态位点与高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量有关，且TT基因型与总样本中较低的VNN1基因mRNA表达水平、较低的HDL-C水平和较高的体重指数（BMI） z-score均呈显著相关，其中VNN1基因表达与HDL-C水平呈正相关，与BMI z-score呈负相关[15-16]。Khan等[17]应用转录组学方法发现，老年海福特牛卵巢颗粒细胞VNN1基因表达量明显高于青年牛。Bunel等[18]研究了在牛卵母细胞发育能力获得期卵丘细胞转录组水平的变化，结果显示，卵丘细胞中VNN1基因的表达与卵泡过度分化相关。综上所述，VNN1基因在小鼠、人和牛中研究较多，但鲜见VNN1基因与山羊产羔数相关的研究报道。

产羔数作为衡量母畜优劣的重要指标，是影响生产效益的重要因素，且山羊产羔数性状属于低遗传力性状，用传统育种方法育种速度慢，而分子育种技术可以筛选更多的优势基因，加快山羊育种进程[19]。本试验采集F3代波杂山羊血液，通过DNA混池、PCR扩增和直接测序法对优异基因进行筛选，以期为后期培育新品系提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 样品采集

选取统一饲养环境下107只F3代初产波杂山羊，F3代波杂山羊是以F2代波杂山羊为母本、贵州白山羊为父本杂交获得，其中贵州白山羊血统占87.5%，波尔山羊血统占12.5%。试验羊及产羔数记录均由务川自治县宏牧羊业有限公司提供，颈静脉采血放入EDTA抗凝管，-20 ℃保存备用。

1.2 主要试剂及仪器

血液DNA提取试剂盒购自Omega公司；2×TaqPCR StarMix购自上海诩圣科技有限公司；DL2000 DNA Marker购自北京擎科生物技术有限公司。超微量分光光度计和高速冷冻离心机均购自Thermo公司；梯度PCR仪购自ABI公司；凝胶成像系统购自Bio-Rad公司。

1.3 血液DNA提取

采用血液DNA提取试剂盒提取F3代波杂山羊血液DNA，采用超微量分光光度计检测提取DNA的浓度和纯度，1.0%琼脂凝胶电泳检测DNA质量。将符合要求的107只F3代波杂山羊血液DNA每管分别吸取0.5 μL至一离心管中混匀，构建DNA混池。

1.4 引物设计及合成

根据GenBank中公布的山羊VNN1基因（登录号：NC_030816.1）全长20 746 bp序列（共有8个外显子区域），采用Primer Premier 5.0软件设计外显子引物（含有部分内含子区域），引物序列见表1。引物均由北京擎科生物技术有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.5 PCR扩增及测序分型

PCR反应体系30 μL：2×TaqPCR StarMix 15 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 12 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55～61 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。将PCR产物送至北京擎科生物技术有限公司测序，利用DNAStar软件将测序结果与NCBI原始序列进行比对，筛选可能存在的SNP位点。

1.6 数据处理

应用Excle软件对各SNP位点基因型分布进行基因型频率、基因频率Hardy-Weinberg遗传平衡检验及遗传多样性分析；应用SPSS 16.0软件对VNN1基因SNP位点与F3代波杂山羊产羔数进行相关性分析，产羔数用平均值±标准差表示，以P<0.05为差异显著性判断标准。

2 结 果

2.1 PCR扩增

以混池DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR扩增片段长约507、703、801、614、685、730和928 bp（图1），与预期目的片段大小一致，可满足后续试验要求。

M，DL2000 DNA Marker;1～7，VNN1基因外显子1-7区域PCR扩增产物M，DL2000 DNA Marker;1-7，PCR amplification of exons 1-7 region of VNN1 gene,respectively图1 VNN1基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of VNN1 gene

2.2 SNPs筛选及分型

测序发现,VNN1基因第1、2、3、4、6外显子扩增区域均无SNP位点，而VNN1基因第5和7外显子扩增区域共存在7个SNPs位点，分别为含第5外显子区域的g.10956 A→G、g.11010 C→T、g.11103 C→T、g.11284 C→A、g.11313 T→C，以及含第7外显子区域的g.18094 C→T和g.18158 G→C（图2）。其中，g.10956 A→G、g.11010 C→T和g.11103 C→T位点为外显子突变，而g.11284 C→A、g.11313 T→C、g.18094 C→T和g.18158 G→C为设计引物时包含的部分内含子突变。

A～G，分别为g.10956 A→G、g.11010 C→T、g.11103 C→T、g.11284 C→A、g.11313 T→C、g.18094 C→T和g.18158 G→CA-G，g.10956 A→G，g.11010 C→T，g.11103 C→T，g.11284 C→A，g.11313 T→C，g.18094 C→T and g.18158 G→C，respectively图2 VNN1基因7个SNPs位点测序峰图Fig.2 Sequencing maps of 7 SNPs of VNN1 gene

2.3 F3代波杂山羊基因型频率、基因频率及遗传多样性分析

由表2可知，g.10956 A→G、g.11010 C→T、g.11103 C→T、g.11313 T→C和g.18094 C→T位点优势基因型为AG或CT（TC），均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05），可进行后续产羔数相关性分析;而g.11284 C→A和g.18158 G→C位点优势基因型为CC或GG，均处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.01），不具有统计学意义。

表2 F3代波杂山羊VNN1基因型频率及基因频率Table 2 Genotype frequency and gene frequency of VNN1 gene in F3 generation Boza goats

由表3可知，VNN1基因7个SNPs位点有效等位基因数在1.926～1.989之间，杂合度在0.481～0.497之间，纯合度在0.503～0.519之间，多态信息含量均为中度多态（0.25

表3 VNN1基因7个SNPs位点的遗传多样性Table 3 Genetic diversity of 7 SNPs of VNN1 gene

2.4 VNN1基因多态性与F3代波杂山羊产羔数的关联分析

对VNN1基因SNPs位点与F3代波杂山羊产羔数进行关联分析，结果见表4。由表4可知，g.11010 C→T和g.11313 T→C位点与F3代波杂山羊产羔数存在显著相关，且g.11010 C→T位点CC基因型显著低于CT和TT基因型；g.11313 T→C位点TT基因型显著低于TC和CC基因型（P<0.05）；g.10956 A→G、g.11103 C→T和g.18158 G→C位点与F3代波杂山羊产羔数均无显著相关（P>0.05）。

表4 VNN1基因多态性与F3代波杂山羊产羔数的关联分析Table 4 Correlation analysis between VNN1 gene polymorphism and lambing number in F3 generation Boza goats 只

续表

3 讨 论

SNP是基因组水平上单个核苷酸变异所导致的DNA碱基序列的改变，属于第3代遗传标记，1996年第一次提出此概念[20]，具有数量多、分布广、代表性强、遗传稳定性好、便于高通量、高度自动化的检测分析等特点[21]。在动物方面，利用SNP方法可以筛选出动物个体间存在的优异基因、优异基因型以及与动物疾病相关的基因等[22]。目前，VNN1基因与牛繁殖性状相关的研究已有报道[17-18]，但鲜见VNN1基因与山羊产羔数相关性的研究。本试验通过DNA混池、PCR扩增和直接测序法发现，VNN1基因在F3代波杂山羊共存在7个SNPs位点，其中外显子5区域存在5个SNPs位点，外显子7区域存在2个SNPs位点。χ2检验显示，g.10956 A→G、g.11010 C→T、g.11103 C→T、g.11313 T→C和g.18094 C→T位点均处于Hardy-Weinberg平衡，说明这些位点可能受人工影响因素较小，适应性较好，有利于优良基因的保存[23]；g.11284 C→A和g.18158 G→C位点均处于Hardy-Weinberg不平衡，推测可能是该群体在自然、人工选择选育过程中被逐渐淘汰，也可能与品种本身有关[24]，在后续产羔数相关性分析中不具有统计学意义。而将处于Hardy-Weinberg平衡的SNP位点进行相关性分析发现，只有g.11010 C→T和g.11313 T→C位点与F3代波杂山羊产羔数呈正相关，是由于各基因中虽然普遍存在SNP位点，但是否存在Hardy-Weinberg平衡以及是否与生产性能等指标存在相关性等，均需要在获得SNP位点后进行分析检验，从而淘汰相当一部分SNP位点[25]。根据分析结果，在后续贵州白山羊新品系育成中，VNN1基因可作为分子选育的候选基因。

贵州白山羊是中国著名的白山羊品种之一，为贵州省目前群体数量最大的山羊品种，贵州白山羊肉质鲜美但体型偏小，为改善贵州白山羊体型的同时基本保持贵州白山羊原有肉质风味，将波尔山羊进行导入杂交的研究已有报道，但均通过传统的选育方法进行。陈浩林等[26]通过传统育种方法，以贵州白山羊为母本、波尔山羊为父本，发现杂交F1代羔羊生长性能优于本地纯繁白山羊。焦仁刚等[27]以波尔山羊和南江黄羊与贵州白山羊进行杂交试验，杂交F1代在体重、日增重等方面与纯种白山羊相比具有显著提高。杨光等[28]利用波尔山羊改良贵州波本F1代并测定其肉质性能，结果显示，该杂交组合不仅能提高生长速度，而且产肉性能十分良好。说明将波尔山羊血液导入贵州白山羊群体，并保持一定血缘比例是行之有效的育种方案，但上述传统育种方案也显示出在新品系育成时耗时较长的缺点，因此，将传统育种与分子育种相结合，能够有效地加快这一新品系的育成。此外，值得注意的是，由于不同遗传背景和统计样本数的限制，关于VNN1基因是否还存在其他未知的SNP位点，以及该位点是否在不同品种之间仍具有统计学指导意义，需要在接下来的育种工作中进一步证实和探索。

4 结 论

在F3代波杂山羊VNN1基因中发现7个SNPs位点，其中，g.11284 C→A和g.18158 G→C位点均处于Hardy-Weinberg不平衡状态，不具有统计学意义，g.10956 A→G、g.11010 C→T、g.11103 C→T、g.11313 T→C和g.18094 C→T位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态，均属于中度多态，可进行产羔数关联性分析，分析结果表明，g.11010 C→T和g.11313 T→C与F3代波杂山羊产羔数存在显著关联。