鸡miR-10b-5p生物信息学及组织表达分析

2022-06-01黄正洋赵振华黄华云李春苗王钱保穆春宇黎寿丰

中国畜牧兽医 2022年4期

黄正洋，赵振华，黄华云，李春苗，王钱保，穆春宇，黎寿丰

（中国农业科学院家禽研究所，扬州 225009）

在表观遗传学研究领域，microRNA研究是一个越来越受到关注的研究热点。microRNA是一种序列高度保守的单链非编码小分子RNA，长度19～25个核苷酸[1-2],主要是通过与靶基因的3′-非翻译区结合形成RNA诱导沉默复合体，从而抑制靶基因翻译，起着负调控的作用。研究表明，miRNA参与了动物生长发育过程中大量基因的表达调控，如细胞的增殖、分化、凋亡等，进而调控动物的肌肉发育以及繁殖等过程[3-4]。

miR-10家族是一个非编码RNA家族，主要包括miR-10a、miR-10b和miR-10c这3个大类，每个大类同时还会有来自前体序列5′-端臂和3′-端臂加工而来的成熟体miRNA。miR-10位于HOX（homeobox family）基因簇内，HOX基因是一类编码高度保守、含有同源结构域的DNA结合转录因子，在生物形态发育过程中起着重要作用。miR-10b-5p是来自miR-10b的5′-端臂的成熟体形式，在调控细胞增殖凋亡中起着重要的功能。目前，已经对miR-10在小鼠[5]、山羊[6-8]、猪[9-11]和鹅[12]等物种上的功能进行了研究，主要研究了在组织间的表达差异、肌肉生长发育、对卵巢颗粒细胞的影响以及对精子发生过程的调控。

鉴于miR-10b-5p与肌肉生长、细胞增殖分化和颗粒细胞凋亡密切关系，以苏禽3号肉鸡为试验动物，通过检索获得常见脊椎动物的miR-10b-5p序列，并进行相应分析；利用数据库比对确定miR-10b-5p在基因组中的位置，根据成熟序列构建系统进化树；使用多个在线软件预测miR-10b-5p靶基因，并进行GO功能和KEGG通路分析；利用实时荧光定量PCR技术检测不同生长时期miR-10b-5p组织表达变化，为进一步揭示miR-10b-5p在鸡肌肉生长及细胞增殖分化中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验选取中国农业科学院家禽研究所邵伯试验基地选育的苏禽3号肉鸡。选取体重接近的1日龄健康个体600只，佩戴翅号，组建试验群体。在相同管理条件下饲养，自由采食及饮水，常规程序免疫接种。3日龄（生长初期）和90日龄（上市前）时，随机选取5只进行放血屠宰，分别采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸肌、腿肌、卵巢、大脑、小脑、垂体和下丘脑等组织样品，立即置于液氮中，带回实验室后-70 ℃保存，用于总RNA提取。

1.2 主要试剂和仪器

miRcute miRNA提取分离试剂盒（DP501）、miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒（KR211）、增强型miRNA荧光定量检测试剂盒（FP411）均购自天根生化科技（北京）有限公司。Applied Biosystems 7500荧光定量PCR系统购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 miR-10b-5p序列的获得

从miRBase 22.1（http:∥www.mirbase.org/）[13]中下载全部物种miRNA成熟序列，筛选miR-10b-5p序列，去除植物等物种的序列，只保留脊椎动物的成熟序列及前体序列。经过筛选，选取以下物种的miR-10b-5p序列：牛（Bostaurus，登录号：MIMAT0003839）、家犬（Canisfamiliaris，登录号：MIMAT0009837）、山羊（Caprahircus，登录号：MIMAT0035913）、豚鼠（Caviaporcellus，登录号：MIMAT0046847）、锦龟（Chrysemyspicta，登录号：MIMAT0037627）、原鸽（Columbalivia，登录号：MIMAT0038406）、灰仓鼠（Cricetulusgriseus，登录号：MIMAT0023737）、鲤鱼（Cyprinuscarpio，登录号：MIMAT0026200）、斑马鱼（Daniorerio，登录号：MIMAT0001268）、马（Equuscaballus，MIMAT0013090）、大西洋鳕鱼（Gadusmorhua，MIMAT0044188）、红色原鸡（Gallusgallus，登录号：MIMAT0001148）、大猩猩（Gorillagorilla，登录号：MIMAT0002491）、人（Homosapiens，登录号：MIMAT0000254）、猕猴（Macacamulatta，登录号：MIMAT0006162）、小鼠（Musmusculus，登录号：MIMAT0000208）、鸭嘴兽（Ornithorhynchusanatinus，登录号：MIMAT0007218）、家兔（Oryctolaguscuniculus，登录号：MIMAT0048099）、绵羊（Ovisaries，登录号：MIMAT0030031）、黑猩猩（Pantroglodytes，登录号：MIMAT0007945）、狐蝠（Pteropusalecto，登录号：MIMAT0039899）、褐家鼠（Rattusnorvegicus，登录号：MIMAT0000783）、大西洋鲑鱼（Salmosalar，登录号：MIMAT0032295）、野猪（Susscrofa，登录号：MIMAT0013885）。

1.4 miR-10b-5p基因定位及序列分析

由于成熟序列较短,可能在基因组中有多个定位，因此，采用Ensembl数据库的BLAST程序（http:∥asia.ensembl.org/index.html），以鸡、山羊、家兔、野猪、牛和斑马鱼等12个物种的miR-10b-5p前体序列作为查询序列，对其基因组数据库进行搜索，以确定miR-10b-5p在基因组染色体上中的位置。选取24种典型物种的24条miR-10b-5p的成熟序列，使用Mega 11.0软件[14]（https:∥www.megasoftware.net/）中Clustal W程序对miR-10b-5p基因的成熟序列进行多序列比对（multiple sequences alignment，MSA），分析序列特点。

1.5 系统发生分析

为使得构建的系统进化树更加准确，选取24种典型物种的24条miR-10b-5p的前体序列，使用Mega 11.0软件中Clustal W程序进行多序列比对分析，采用基于距离参数的邻接法（Neighbor-joining,NJ），并自展分析（Bootstrap）1 000次，构建miR-10b-5p基因的系统进化树。

1.6 miR-10b-5p靶基因预测及功能分析

利用3个在线软件microT[15]（http:∥diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=microtv4/index）、miRDB[16]（http:∥www.mirdb.org）和TargetScan[17]（http:∥www.targetscan.org/vert_71/）预测gga-miR-10b-5p的靶基因，取3个软件的交集以降低预测结果的假阳性。对获得的靶基因使用在线工具DAVID[18]（https:∥david.ncifcrf.gov/）进行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.7 引物设计与合成

根据NCBI上红色原鸡gga-miR-10b-5p序列（登录号：NR_031440.1），利用miRNA Design v.1.01软件采用加尾法设计引物进行定量分析，以U6为内参基因，引物信息见表1。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 miR-10b-5p 实时荧光定量PCR引物Table 1 Sequences of the oligonucleotide primers for Real-time quantitative PCR

1.8 miRNA提取及反转录

采用miRcute miRNA提取分离试剂盒提取各组织样品miRNA。每个样品取3 μL总RNA，使用miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒，进行miRNA第一链cDNA的反转录（采用加A法）。反应体系：Total RNA 2 μg，2×miRNA RT Reaction Buffer 10 μL，1×miRNA RT Enzyme Mix 2 μL，RNase-free ddH2O补至20 μL。反应程序：42 ℃ 60 min；95 ℃ 3 min。合成的cDNA反应液置于-20 ℃保存备用。

1.9 miR-10b-5p在鸡不同组织内的定量表达检测

采用SYBR Green Ⅰ嵌合荧光法检测心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸肌、腿肌、卵巢、大脑、小脑、垂体和下丘脑等组织样品中miR-10b-5p表达量，反应条件和程序按照miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒说明书操作。PCR反应在Applied Biosystems 7500荧光定量PCR系统中进行，U6基因作为内参。

1.10 统计分析

采用2-ΔΔCt法分析miR-10b-5p在鸡不同组织中的相对表达量，每个样品重复3次。试验结果以平均值±标准差表示。用SPSS 26.0软件独立样本t检验进行统计分析，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 miR-10b-5p家族分析

通过文献和miRBase检索共获得59种动物的59条miR-10b-5p序列，即所查到的每种动物中都只有1种miR-10b-5p形式。由于miR-10b家族基因数量的不同，导致miR-10b-5p呈现出以下2种形式：miR-10b和miR-10b-5p。在鸡中miR-10b的成熟体形式为miR-10b-5p。选取了常见的红色原鸡、山羊、兔、人、斑马鱼等12个物种的miR-10b-5p前体序列作为查询序列（query sequence），通过BLAST搜索确定各序列在基因组中的位置，如表2所示。基因定位显示，与其他miRNA类似，miR-10b-5p大部分都位于基因的间隔区（intergenic region，IGR），鸡miR-10b-5p定位在7号染色体上，位于HOX基因家族基因间隔区。

表2 miR-10b-5p基因家族在基因组中的定位Table 2 Genomic location of miR-10b-5p gene family

2.2 miR-10b-5p序列分析

选取24种典型物种的24条miR-10b-5p的成熟序列进行多序列比对分析，结果如图1所示，miR-10b-5p的成熟序列相似性很高，序列长度（22～24 nt）相近，保守的碱基数19个，分别为第3-18和20-22位碱基，说明miR-10b-5p在不同物种间具有高度保守性。比对结果显示，miR-10b-5p在部分物种在前两位和最后两位碱基存在不同程度缺失，在大西洋鳕鱼第19位碱基出现了U>G的突变。

*，表示序列一致；-，表示碱基缺失*，Represent highly conserved bases；-，Indicate base deletion图1 miR-10b-5p基因家族的成熟序列比对Fig.1 Multiple sequence alignment of mature sequence of miR-10b-5p gene family

2.3 miR-10b-5p系统进化树的构建

采用Mega 11.0软件，以代表性物种的miR-10b-5p序列的前体序列miR-10b构建基于距离参数的邻接法系统发育进化树，结果如图2所示，miR-10b前体序列在哺乳类中的灵长目、啮齿目、鸟类、鱼类中各自先聚为一支，然后再共同聚为一类。这表明miR-10b基因在各个物种内是保守的。

图2 miR-10b基因家族系统发育进化树Fig.2 Phylogenetic tree of the miR-10b gene family

2.4 miR-10b-5p靶基因预测及功能分析

使用3种miRNA在线靶基因预测软件microT、miRDB和TargetScan分别预测到67、107和228个鸡miR-10b-5p靶基因，取3个软件的并集共得到300个靶基因（图3）。

图3 鸡miR-10b-5p靶基因预测结果Fig.3 Prediction results of target genes of miR-10b-5p in chickens

对预测获得的靶基因使用在线工具DAVID进行GO功能分析，结果如图4所示，在生物过程分类中，靶基因主要富集到端粒异染色质组装、染色体凝聚负调控、着丝粒复合体组装的调控、心周异染色质组装和基因表达的转录后调控等;在细胞组分分类中，靶基因主要富集到组蛋白甲基转移酶复合物、转录因子复合物、细胞质核周区和细胞质膜;在分子功能分类中，靶基因主要富集到电压门控钠通道活性，RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、配体激活序列特异性DNA结合，转录抑制物活性、RNA聚合酶Ⅱ转录调控区序列特异性结合，RNA聚合酶Ⅱ远端增强子序列特异性DNA结合，类固醇激素受体。

图4 靶基因GO功能富集分析Fig.4 GO function enrichment analysis of target genes

对靶基因进行KEGG通路富集分析，结果如表3所示，靶基因主要富集到Wnt信号通路（Wnt signaling pathway）、RNA转运（RNA transport）和p53信号通路（p53 signaling pathway）。多个与肌肉生长及细胞增殖等相关的基因富集到相关通路之上，如细胞周期蛋白D3（Cyclin D3，CCND3）、WNT9A（wingless-type MMTV integration site family,member 9A，WNT9A）、BTRC（Beta-transducin repeat containing E3 ubiquitin protein ligase，BTRC）和S相激酶相关蛋白1（S-phase kinase-associated protein 1，SKP1）等。

表3 miR-10b-5p家族预测靶基因的KEGG信号通路数据库富集分析结果Table 3 KEGG pathway exrichment results of miR-10b-5p predicted target genes

2.5 miR-10b-5p在鸡不同日龄和不同组织中的相对表达量

对心脏、肝脏、卵巢和胸肌等不同组织miR-10b-5p进行了检测，结果如图5所示，miR-10b-5p在检测的各个组织中均有表达；3日龄时大脑、小脑、垂体、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表达量显著高于心脏、下丘脑、肾脏和肺脏等组织（P<0.05）；90日龄时，垂体、胸肌、腿肌和大脑中miR-10b-5p表达量显著高于其他组织（P<0.05）。与3日龄雏鸡相比，90日龄鸡垂体、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表达量均显著上升（P<0.05）。

①同一日龄不同组织间比较，肩标不同字母表示差异显著（P<0.05）；肩标相同字母表示差异不显著（P>0.05）。②同一组织不同日龄间比较，*，差异显著（P<0.05）；无*，差异不显著（P>0.05）①Comparison between different tissues at the same age,values with different letter superscripts mean significant difference （P<0.05）;While with the same letter superscripts mean no significant difference （P>0.05）.②Comparison between different ages of the same tissue，*，Significant difference （P<0.05）；No *，No significant difference （P>0.05）图5 miR-10b-5p在不同日龄鸡组织中的相对表达量Fig.5 Relative expression of miR-10b-5p in different tissues of chickens at the different age

3 讨论

miRNA作为一种内源性调控因子，参与了畜禽多种生物调控，如细胞增殖、分化及凋亡等。miRNA要发挥其调控作用，主要是作用在靶基因3′-UTR区，形成沉默复合物，使得靶基因翻译受到抑制，从而发挥调控功能。准确找到miRNA的靶基因，对于研究miRNA功能至关重要。而目前的研究方法主要是前期通过生物信息学方法进行预测，后期通过敲除或者干扰试验来验证其靶向关系。

miR-10b-5p是miR-10b的5′-端成熟miRNA，在人类中，miR-10b定位于2号染色体上，位于HOXD4与HOXD8基因间隔区。而在鸡中，miR-10b定位于7号染色体上，位于HOXD3与HOXD13基因间隔区。在其他物种中也发现miR-10b都在HOX基因簇中，这说明miR-10b和HOX基因关系密切，HOX基因在动物发育过程中发挥着重要作用，miR-10b和HOX基因可能共同参与调控动物的发育过程。方芳[6]对多羔和单羔奶山羊发情期卵巢组织差异表达的miRNAs进行筛选，对获得的差异表达显著的miR-10b靶基因以及在卵巢颗粒细胞中的表达进行分析，通过荧光素酶报告载体和实时荧光定量PCR验证BDNF是miR-10b的靶基因，miR-10b通过抑制BDNF基因的表达从而抑制卵巢颗粒细胞活性。郭乐薇等[19]将miR-10b模拟物和miRNA模拟物转染到牛卵巢颗粒细胞中发现，凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax表达量显著下降，说明miR-10b可促进牛卵巢颗粒细胞凋亡。因此，miR-10b-5p在颗粒细胞中主要是抑制某些基因的表达，促进细胞凋亡。目前在多个繁殖相关组织中都筛选出了miR-10b-5p[7,10,11,20-22]。本研究对miR-10b-5p进行组织表达分析，发现在大脑、小脑、垂体、胸肌、腿肌和卵巢中表达量均较高。对3和90日龄的组织器官中miR-10b-5p表达变化进行检测，发现90日龄垂体、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表达量均显著高于3日龄。其原因可能是在生长后期miR-10b-5p同样会抑制生长相关基因的表达，使得生长速度减慢，这在一定程度上说明miR-10b-5p可作为评价鸡生长速度的一个标志物，进而指导肉鸡选育工作。

在对miR-10b-5p进行基因定位分析发现，鸡miR-10b-5p位于7号染色体上的基因间隔区，这与以往的研究类似[12,23-24]。推测可能是由于其位于基因间隔区，在不破坏附近基因结构的情况下可以调控上下游基因的表达，提高了调控效率。通过对常见物种miR-10b-5p成熟序列比对分析发现，不同物种miR-10b-5p的成熟序列物种间较为保守。进化树分析发现，miR-10b前体序列在灵长类、啮齿类、鱼类和鸟类中各自先聚为一支，然后再共同聚为一类，这也证明了miR-10b基因在各个物种内是保守的。目前，通过对以往的文献[25-26]分析可知，对miRNA靶基因的预测和生物信息学分析主要是通过JASPAR、PROMO、miRanda、RNAhybrid、miRDB、miRWalk和TargetScan等生物信息学软件进行，本研究选取了其中3个常用的在线软件进行了预测。靶基因预测和功能分析发现，miR-10b-5p共有300个靶基因。GO功能分析结果表明，靶基因主要富集到染色质组装和基因表达的转录后调控、组蛋白甲基转移酶复合物、转录因子复合物、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性和RNA聚合酶Ⅱ远端增强子序列特异性DNA结合等功能。KEGG通路富集分析表明，靶基因主要富集到Wnt和p53信号通路，这些信号通路与肌肉生长发育、细胞增殖分化密切相关。