农药残留快速检测技术的发展现状及微流控技术在农残快检中的应用前景

许晶冰，蔡灵利

摘要 现阶段，农药残留快速检测技术应用最广泛的是酶抑制率法，此法在市场监管的基层执法中应用最多，但其先天存在很多不足，也使其使用效果大打折扣。而胶体金免疫层析法的优势虽然在于定性能力强、检出限更低，但其成本较高且只能做单一农药残留，在基层应用中效率太低从而未被广泛应用。微流控技术可以结合酶抑制率法的优势，在短时间内完成全自动检测，具有较好的应用前景。

关键词 农药残留;酶抑制率法;胶体金免疫层析;微流控

中图分类号：S481.8 文献标识码：B 文章编号：2095–3305（2022）03–0161–03

调查表明，农药残留问题与我国大约40%食品安全事件相关，是民众最为关心的问题。近年来，食品安全快速检测逐渐普及和推广应用。据食品药品监督管理部门发布的抽检监测数据，2020年，重庆市食品安全监管部门共完成食品安全监督快速检测9万余批次，其中食用农产品抽查是食品安全日常监管的重中之重，食用农产品数量为4.7万批次，占比约54%，快速检测抽检项目主要是农药残留。目前，用于农药残留快速检测的技术主要是2类：一类是基于国家快检标准酶抑制率法的相关试剂盒，一类是基于胶体金免疫层析技术的胶体金试纸条产品。

1 酶抑制率法

酶抑制率法是利用有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用这一特点，在加入一定量酶反应底物和胆碱酯酶的条件下，进行催化反应，通过底物被酶催化反应的程度来判断样品中是否含有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药。

1.1 纸片法

纸片法是基于酶抑制率法原理设计的快速检测样品中农药残留的方法，其利用胆碱酯酶能够催化红色的靛酚乙酸酯水解为蓝色的靛酚这一显色特性，将胆碱酯酶和靛酚乙酸酯固化在纸片上，加入样品提取液后，在37℃的条件下进行催化反应，通过观察纸片的颜色变化来判定样品中是否含有高剂量农药。

使用此法检测样品中农药残留的成本最低，且操作简便，但其不足之处在于对于显色情况的判定只能依靠检测人员的经验，如果样品本身有颜色，也会干扰检测人员对结果的判定。因此，在实际的监管中，应用存在很大局限性。

1.2 分光光度法

分光光度法是利用有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能的抑制作用，且在一定浓度范围内，抑制率与农药的含量呈正相关这一特性，在反应体系中加入胆碱酯酶、乙酰胆碱及能与乙酰胆碱的水解产物发生显色反应的显色剂，在特定波长下测定吸光度随时间的变化情况，计算出抑制率，通过抑制率可判断出样品中是否含有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药。因此，此法也叫酶抑制率法。

酶抑制率法是目前应用最为广泛的农药残留快速检测方法，被用于农产品批发市场、农贸市场、商超和基层监管部门的快检实验室中。其最大优势在于检测成本低，单个样品检测成本低于1元，并且实验操作过程相对简单，对于检测人员的专业要求不高。

1.3 酶抑制率法存在的不足

第一，样品中的物质对胆碱酯酶活性的影响：影响胆碱酯酶活性的因素是多方面的，而某些特殊样品如香辛料类、洋葱等样品中的物质亦会抑制酶活性，从而造成假阳性的结果。第二，样品的颜色对检测结果的影响：不管是纸片法还是分光光度法，均是通过观察颜色变化来读取检测结果，样品中若含有可溶于提取液的色素，则会对检测结果造成干扰。第三，方法原理的局限性：该方法无法对样品中的农药进行定性，即使检出阳性结果，也不知道样品中具体是什么农药。第四，方法未考虑多种农药的交互叠加作用：该方法结果判定成立的背景是假设样品中仅含有单一农药，但实际情况是多种农药的混合使用，而该方法没有考虑多种农药的叠加效应（即可能样品中含有4～5种农药，但均未超过限量标准），从而导致检测结果出现假阳性。

1.4 酶抑制率法方法优化研究现状与分析

酶抑制率法已编入卫生部颁发的国家标准《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》（GB/T 5009.199—2003）中，该方法较成熟，近年来国内外相关研究主要是在反应条件及方法学上进行优化。杨建平[1]研究发现，乙酰胆碱酯酶在37℃、pH值7.8～8.0时表现出最大活力，适当延长反应放置时间，可以提高检测的灵敏度。钟树明等[2]研究发现，用前处理小柱对样品进行预处理，可去除叶绿素的干扰、提高检测灵敏度，提高抑制率阈值15%。李顺等[3]通过正交试验和极差分析得出，酶抑制率法最佳检测条件为抑制时间15 min、抑制温度35℃、底物加入量100 μL、酶液加入量100 μL。杨东鹏等[4]提出了新的最适条件确定标准，即保证酶的活性保持在一定水平的基础上，选择抑制率（以甲胺磷为抑制剂）最高时的温度47.0℃、pH值7.7和抑制时间10 min为最适条件。

2 胶体金免疫层析法

目前，大多数胶体金免疫层析产品采用竞争性抑制免疫层析原理，及样品中的目标物经特定前处理方式提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体与检测线上的抗原结合，通过观察检测线颜色的深浅来判定样品中目标物的含量。

调研发现，目前市场销售的胶体金农药残留快检试纸条所能覆盖的农药残留项目不多，主要有克百威、三唑磷、氟虫腈、水胺硫磷、甲基异柳磷、腐霉利、毒死蜱、高效氯氰菊酯、丙溴磷、敌百虫、氧乐果等十余项农药残留。

此法的主要优势在于：（1）特异性强，免疫层析技术通过在目标物上寻找特定的结合位点，能够与目标物进行特异性结合，因此，对于定性检测，存在先天优势;（2）检出限低，对于目标物检测，通常都能够做到ppb级的检出限，能够检测样品中的微量农残;（3）对于检测仪器的依賴性不高，不需要购置大型检测仪器，多数情况下肉眼即可判断检测结果。

此法的主要缺陷在于：（1）检测成本较高，每项次检测试纸条成本约10元;（2）测定目标物单一，每种试纸条只能检测单一目标物，而我国具有限量的限用和禁用农药在《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2021）中，共规定了564种农药10 092项最大残留限量，对于单一农药的检测不能满足日常监管的需求。

3 微流控技术的研究现状与分析

微流控技术，又称微流控芯片技术，是将样品制备、反应、分离、检测等生化反应过程集成到厘米尺度的芯片上的技术。它起源于毛细管电泳技术，随着PDMS软刻蚀和微阀微泵技术的应用推广，微流控芯片逐渐成为一个重要的技术平台。

3.1 纸基微流控芯片

纸芯片微流控技术是一种新型微流控技术。相比于以玻璃、石英、高聚物等为基底的传统微流控芯片，纸芯片具有成本低、易操作、可携带、耗样量小等优点。

纸基微流控芯片结合了微流控和纸的优点，在纸的表面加工出具有一定结构的流体通道微型分析器件。流体在纸上通过毛细作用流动，需要的试样量更少，且分析步骤简便易操作，适合于现场的便携式检测。基于纸基芯片的检测方法，主要包括了荧光法、电化学发光法、电化学检测法、光度检测法等，其中光度检测法和电化学方法是目前应用最多的。纸基芯片在临床血液检测中的应用较为广泛，例如，在临床分析中，常用的葡萄糖检测方法是利用葡萄糖和GOx、HRP混合物的显色反应进行定量分析。

在食品安全分析领域，纸基微流控芯片被应用于致病菌、重金属及蔬菜表层的农药残留检测中。Henry 课题组[5]利用细菌产生的酶和显色底物反应进行比色法检测成功在纸芯片上检测大肠杆菌、沙门菌以及单核细胞增生李斯特氏菌，检出限可达10 cfu /cm2，达到了标准方法的检测范围，与传统的医学方法相比，大幅度缩短了富集时间。

3.2 离心式微流控芯片

微流控检测近年来得到快速发展，在生物检测、食品检测等领域已有成功应用。图1为在新型冠状病毒核酸检测中成功应用的基于微流控技术制备的核酸检测芯片，该芯片在1.5 h内便可一次性检测包括新型冠状病毒（2019-nCoV）在内的6种呼吸道常见病毒，且可实现多个样品批量处理，为患者及一线医务人员提供快速、精确、有效的诊断。

此外，Guan等[6]在构建的聚二甲基硅氧烷 （PDMS） /玻璃微流控芯片与微珠组成的免疫分离平台上，采用生物发光技术检测食源性病原体;Birnbaumer等[7]建立了一种新型的微全分析系统，能够持续监测病毒污染，具有较高的灵敏度和良好的选择性;Bergeron[8]最早发展了实时PCR检测技术，并成功将其市场化，用于檢测B组链球菌、甲氧西林、抗药性金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌和难辨梭状芽孢杆菌，近年来他所带领的团队又开发一个微向心力设备，可以实现无需培养的食源性病原快速检测。Min等[9]开发了一种基于PCR的分子诊断装置，包括微流控芯片和离心力辅助的液体操作管（CLHT），后者可在单管内实现目标DNA的浓缩、纯化和放大。

在食品检测领域，针对苏丹红的检测，Liu等[10]通过两层芯片间夹滤膜的方式发展了一种真空加速微流体免疫方法（VAMI）。Jiang等[11]设计了一个塑料微流控装置用于食品中污染物的高通量检测，其中，微流控网格以聚酯和聚二甲基硅氧烷为材质，采用硅模板印迹和毛细管成型技术制得，检测方法采用亲和捕获、浓缩和电喷雾粒子质谱方法，聚氯乙烯膜被夹于印迹化的共聚物微通道中，形成一个整合平台，用于对包含黄曲霉毒素B1抗体和黄曲霉毒素的连续亲和透析和浓缩。

3.3 离心式微流控技术在农药残留检测中的应用情况

将离心式微流控技术应用于农残快速检测中，目前已有一些研究基础。中国计量大学申请了“一种基于双光谱技术的微流控农药残留检测方法”发明专利，其主要将拉曼光谱与微流控模块结合，将光信号转变为电信号，预期实现样品中农药残留的定性定量检测。

深圳海关食品检验检疫技术中心申请了“一种基于花状纳米银衬底的农药残留快速检测系统”实用新型专利[12]，其利用离心式微流控来控制液体流向及反应时间，将荧光检测装置用于获取所述圆盘阵列结构的芯片实验室中待测农药的光强度信号，通过采集农药的光强度信号进行农残检测。

广州安诺科技股份有限公司申请了“一种基于DELFIA 的农残检测装置及检测方法”发明专利，其设计了一种基于DELFIA 的农残检测装置及检测方法，包括离心盘和荧光检测机构的分析仪，固定设置在离心盘上并通过离心作用获取检验液的微流控芯片。微流控芯片内部沿离心盘的径向由内至外依次设置有样品孔、过滤孔、第一反应孔、第二反应孔以及废液孔;样品孔、过滤孔、第一反应孔、第二反应孔以及废液孔之间依次通过微流道连通，在各微流道口分别设置有不同厚度的糖膜，不同厚度的糖膜根据不同的离心转速而分别开启微流道;样品孔用于容纳农残检验液的样品溶液并通过离心转动而搅拌均匀;从而检测出农作物样品中农药残留的含量。

苏州汶颢芯片科技有限公司申请了“一种检测农药残留的离心式微流控芯片及其制备方法”的发明专利，其设计了一种用于农药残留检测的离心式微流控芯片，该芯片是带微结构和微通道的圆片状芯片，由多层芯片组成，在离心机旋转产生的离心力驱动下，实现待测样品与反应试剂的混合、萃取、反应、分离和显色过程，最后用紫外可见光分光光度计定量检测出样品中农药残留的含量。

广东顺德中山大学卡内基梅隆大学国际联合研究院申请了“多通道微流控荧光检测装置和方法”的发明专利，该荧光检测装置和方法采用双栅极光电薄膜晶体管，并将其和多通道微流控芯片集成，形成集成化和微型化的多通道的微流控荧光采集系统进行荧光信号收集和检测，具有较高的光灵敏度和光电导增益，非常适用于荧光检测，并且其制备难度和成本较低、功耗小、集成度高，适用于大面积制作，实现阵列化。叶嘉明等基于酶抑制原理结合光度分析方法，研制了一种预存储生化试剂的离心式微流控芯片，结合自行研制的便携式分析装置，可以同时检测12个样品，实现了样品的半自动化检测。

盐城工学院申请了“一种基于表面增强拉曼光谱和纸质微流控芯片的茶叶中农药残留检测方法”发明专利，其基于表面增强拉曼光谱和纸质微流控芯片技术开发了一种茶叶中农药残留的检测方法，可做茶叶中农药残留的定性定量检测。

蘇州汶颢芯片科技有限公司申请了“微流控芯片及其在农药检测中的应用”的发明专利，其检测单元分别包括一萃取池、一微通道和一检测池，微通道的两端分别连通于所述萃取池和检测池，萃取池、检测池和中心点共线，且所述萃取池和检测池分别位于所述中心点的近端和远端。此微流控技术可实现多个样品的在线分离和平行检测，试剂和样品量耗损微量，大大降低了农药的检出限。

通过现有的文献分析，目前的研究主要集中于将微流控技术与拉曼光谱相结合，或微流控技术与荧光模块相结合，微流控平台包括纸基微流控和离心式微流控，其核心反应还是以酶抑制反应为基础的显色反应，其中，拉曼光谱可以用于定性检测。

4 农药残留快速检测技术的发展方向

4.1 优化酶抑制率法

目前，对酶抑制率法优化的研究主要集中在反应环境条件的优化上，这有效提高了酶抑制率法的灵敏度和准确性，但对影响反应体系的因素考虑不够系统、全面，对酶的来源、缓冲液、不同样品的基质干扰等关注较少，相关研究还需深入。

4.2 将酶抑制率法与微流控技术结合

将微流控技术应用于农药残留检测的研究，有助于精确控制酶抑制反应的反应体系、反应温度及反应时间，实现多个样品批量检测，辅以胆碱酯酶的优选及前处理技术优化，能大大提升检测效率、结果的稳定性及准确性。首先，通过筛选高效胆碱酯酶、控制底物及反应体系的多种因素、排除基质干扰等，系统优化酶抑制率法体系，获得高灵敏度的酶抑制率法农残检测体系;其次，基于微流控技术，设计合理芯片结构、离心反应条件等，获得微流控自动化检测参数;最后，开发出基于微流控技术的农残高通量快速检测试剂盒，提高基层快速检测的效率及检测结果的可靠性。此外，在遇到含有深色素的样品时，可见光变化的传统方法会受到严重干扰从而影响结果判断。通过荧光底物及相关体系，同时建立荧光法的酶抑制率方法，实现荧光、可见光双通道的信号输出，可有效提升方法的适用性。

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责任编辑：黄艳飞

Development Status of Rapid Detection of Pesticide Residues and Application Prospect of Microfluidic Technology in Rapid Detection of Pesticide Residues

XU Jingbing et al（Chongqing Institute of Food and Drug Inspection and Testing， Chongqing 401121）

Abstract At present， the most widely used rapid detection technology of pesticide residues is enzyme inhibition method， which is most widely used in the grassroots law enforcement of market supervision， but it has a lot of congenital deficiencies， which also makes its use effect greatly reduced. Although colloidal gold immunochromatography has the advantage of strong qualitative ability and lower detection limit， its cost is high and it can only be used as a single pesticide residue， so its efficiency is too low in basic application， so it has not been widely used. Microfluidic technology can combine the advantages of enzyme inhibition rate method， complete automatic detection in a short time， and has a good application prospect.

Key words Pesticide residues; Enzyme inhibition; Colloidal gold immunochromato-graphy; microfluidic