柱色谱-紫外可见分光光度法测定黄连下脚料中生物碱的含量

钱茂升 ， 周海梅 ， 韩 立 ， 卞 华 ， 徐兴敏*

(1.河南科技大学 法医学院 ， 河南 洛阳 471023 ； 2.南阳理工学院 河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室 ， 河南 南阳 473004)

黄连主要含小檗碱、黄连碱、表小檗碱、巴马汀等生物碱，目前主要采用黄连药材的根块来提取，发挥药效作用[1-2]。而黄连叶柄、叶茎、根须这些下脚料，据记载也含有可观的药效成分，但尚未得到充分利用，造成较大的资源浪费。目前从黄连中提取小檗碱类的测定方法也多为高效液相色谱法等，测定黄连下脚料中生物碱含量的研究鲜有报道[3-4]。本实验以开发黄连药材的全面利用为目的，从黄连下脚料出发，采用柱色谱-紫外可见光光度法对黄连下脚料中生物碱的含量进行测定，方法简单，结果稳定可靠[5-6]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；KQ-400DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；高速多功能粉碎机-200Y，永康市铂欧五金制品有限公司；电子分析天平，上海佑科仪器仪表有限公司； SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂；色谱用氧化铝柱，洛阳市新慕实验仪器有限公司。

1.2 试药

黄连下脚料，河南永超生物科技有限公司提供；盐酸小檗碱对照品，购于合肥博美生物科技有限责任公司；层析碱性氧化铝，天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇、盐酸，试剂均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

准确称量盐酸小檗碱1 mg，用甲醇溶解于10 mL容量瓶中，定容至刻度，倒置摇匀。用移液管准确量取2 mL溶液置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，倒置摇匀，即得20 mg/L的盐酸小檗碱对照品溶液[7]。

2.2 供试品溶液的制备

①将黄连下脚料粉碎研磨，过二号筛；②准确称取粉末5 g，置于250 mL具塞锥形瓶中，准确加入盐酸-甲醇(1∶100)溶剂100 mL，称定质量，摇匀静置一段时间；③超声处理30 min，时时振荡，冷却至室温称定质量，用前述溶剂补齐质量，摇匀抽滤；④准确量取滤液5 mL，至碱性氧化铝柱上(20 g，湿法装柱，用30 mL甲醇预洗)，30 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，倒置摇匀；⑤准确量取洗脱液1 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，振荡摇匀，即得供试品溶液[8-10]。

2.3 测定波长的选择

将对照品溶液、供试品溶液置于紫外可见分光光度计上，在200～700 nm波长范围内分别进行扫描，紫外光谱图见图1。由图1可见，对照品溶液与供试品溶液的光谱图线性相似，在229 nm处都有最大吸收峰，确定本实验的测定波长为229 nm。

图1 紫外光谱图

2.4 标准曲线的建立

分别准确量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶剂定容至刻度，倒置摇匀。按照紫外分光光度法，以甲醇溶剂为空白对照，在229 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，盐酸小檗碱浓度(mg/L)为横坐标进行线性回归，建立标准曲线，得到线性方程y=0.072 12x-0.000 8，R2=0.999 8。结果表明，在2～12 μg/mL内吸光度与盐酸小檗碱浓度线性关系良好。

2.5 精密度实验

按照2.1方法制备得浓度为8 mg/L的盐酸小檗碱对照品溶液，在波长229 nm处连续测定5次，测得吸光度分别为0.576、0.575、0.576、0.577、0.577。5次测定的相对标准偏差RSD为0.12%，表明实验用紫外可见分光光度计精密度良好。

2.6 重复性实验与含量测定

按照2.2的方法制备供试品溶液5份，在波长229 nm处分别进行吸光度测定，实验结果如表1所示。结果表明：黄连下脚料中生物碱的平均含量为4.66%，实验结果重复性高，方法稳定。

表1 含量测定与重复性实验结果

2.7 稳定性实验

按照2.2的方法下制备得供试品溶液，在229 nm波长下，每隔6 h进行吸光度测定，测定结果分别为0.338、0.341、0.333、0.334、0.331，其相对标准偏差RSD为1.2%，表明供试品溶液的稳定性良好，在24 h之内均可测定。

2.8 回收率实验

准确称量黄连下脚料粉末0.5 g，称定5份，过碱性氧化铝柱前，准确加入浓度为0.1 mg/L的对照品溶液1.2 mL，按照2.2的方法和条件操作制备供试品溶液，在229 nm波长处分别测定吸光度，计算加标回收量和回收率，实验结果见表2。结果表明：实验回收率在95.00%～102.50%，平均回收率为98.17%，相对标准偏差RSD为3.03%，该实验测定方法准确可靠。

表2 回收率实验结果

3 结论

黄连下脚料成分复杂，采用碱性氧化铝柱层，紫外分光光度法测定其有效成分生物碱的含量，能较好地消除杂质对测定的干扰，可以作为研究黄连下脚料小檗碱类含量的分析方法。

采用紫外可见分光光度法测定生物碱含量时，其最大吸收峰在波长228、265、346、430 nm附近，最大吸收峰的位置可能受不同溶剂的影响。本实验对照品溶液与供试品溶液在229 nm波长处有最大吸收峰，所以选择229 nm作为黄连下脚料中生物碱含量的测定波长。

目前对黄连下脚料中生物碱含量的研究较少，常见的方法有高效液相色谱法和薄层扫描法，而采用紫外可见分光光度法操作便捷，方法可靠，准确稳定。通过本实验研究表明，在2～12 mg/L浓度范围内浓度与吸光度线性关系良好，以标准曲线法测得黄连下脚料中生物碱的平均含量为4.66%，平均回收率为98.17%，重复性实验RSD为1.3%，为黄连下脚料中小檗碱类的研究提供数据参考，为黄连药材的全面开发应用提供一定的实验依据。