芝麻油中芝麻素、芝麻林素和细辛素检测方法优化

刘春梅，林春兰，刘昌树，郑绣蒨

(佳格食品(中国)有限公司，江苏 太仓 215400)

芝麻油不仅具有食用价值，也具有药用价值，是我国食用历史悠久的一种植物油。芝麻油因香味浓郁、营养丰富而受广大消费者的喜爱。人们很早就发现芝麻油能长期存放不易发生氧化酸败，具有较高的氧化稳定性[1]。这是因为芝麻油中不仅含有生育酚、甾醇等活性物质，还含有木脂素类化合物，这些木脂素类化合物的存在使芝麻油的氧化稳定性比其他食用油高[2]。芝麻木脂素除了具有抗氧化作用外，还具有保护肝脏、调节脂质代谢、降低胆固醇和抗癌等生理活性[3]。而在芝麻油加工过程中形成的细辛素还具有抗真菌、抗药物过敏等功能[4-6]。因此，很多学者对芝麻木脂素类化合物进行了一系列的研究。

芝麻木脂素的分析检测方法有高效液相色谱法(HPLC)[7-12]、薄层色谱法(TLC)[13]、气相色谱法(GC)[14]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[15]、超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)[16]等，其中HPLC应用最为广泛。样品前处理方法有溶剂提取法[7-10,17]、固相萃取法[18-21]、皂化法[22]等，其中溶剂提取法操作简单、应用范围广。目前现行的国家标准(GB/T 31579—2015)《粮油检验 芝麻油中芝麻素和芝麻林素的测定 高效液相色谱法》中用氨基固相萃取柱和硅胶固相萃取柱串联的固相萃取法对样品进行前处理，此方法操作烦琐，存在回收率或重复性不佳等问题，且试验成本较高、耗时长，只检测芝麻素和芝麻林素两种组分。这两种组分是芝麻油中含量较高的两种木脂素组分，此外芝麻酚和细辛素也是比较常见的木脂素组分。细辛素是芝麻油在精炼过程由芝麻素异构化而成[5]，因此细辛素可以作为精炼芝麻油的一种特征指标。芝麻酚在精炼和未精芝麻油中均有可能存在，但实际检测中发现其含量较低[7]。因此，本文主要研究芝麻油中芝麻素、芝麻林素和细辛素3种组分的分析检测方法。参照文献[7,9]，采用有机溶剂提取、HPLC同时分析芝麻油中3种木脂素组分，优化溶剂提取条件以提高检测的精密度，建立一种操作简单、快速、检测成本低、精密度高的方法，准确定性和定量芝麻油中芝麻素、芝麻林素和细辛素含量。

1 材料与方法

1.1 试验材料

芝麻油样品，购自当地超市；芝麻素标准品(CAS号为607-80-7，纯度≥98.8%)、芝麻林素标准品(CAS号为526-07-8，纯度≥99.5%)、甲醇(色谱纯)，上海安谱科技有限公司；细辛素标准品(CAS号为133-04-0，纯度≥98%)，麦克林生化科技有限公司；超纯水。

Agilent 1260高效液相色谱仪(配G7114A紫外检测器)，美国安捷伦公司；分析天平，Sartorius公司；涡旋混匀器，美国精骐有限公司；超声振荡仪，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准品配制

标准储备液配制：分别精确称取芝麻素、芝麻林素和细辛素标准品各20 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，得质量浓度为2 mg/mL的芝麻素、芝麻林素和细辛素标准储备液。

标准工作液配制：各取1 mL芝麻素、芝麻林素和细辛素标准储备液，分别用甲醇定容至10 mL，得质量浓度为200 mg/L的芝麻素、芝麻林素和细辛素标准中间液。标准中间液用甲醇进一步稀释，得到芝麻素、芝麻林素质量浓度分别为4、8、20、40、100 mg/L和细辛素质量浓度分别为1、4、8、20、40 mg/L的标准工作液，上机前配制。

1.2.2 液相色谱条件

ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇-水(体积比75∶25)；流速1 mL/min；进样量10 μL；柱温30℃；紫外检测器波长287 nm。

1.2.3 样品前处理

称取0.1 g芝麻油样品于离心管中，加入5 mL甲醇，涡旋2 min以混合均匀；超声2 min(超声频率为40 kHz)，以4 500 r/min离心2 min，取上层清液于10 mL棕色容量瓶中。再分别用3 mL和2 mL甲醇进行上述提取步骤，合并上层清液，并用甲醇定容到10 mL。

1.2.4 试样中芝麻素、芝麻林素和细辛素的测定及含量计算

标准工作液经0.22 μm有机滤膜过滤后进行HPLC分析，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。样品提取液过0.22 μm有机滤膜后进行HPLC分析。

试样中芝麻素、芝麻林素和细辛素含量的计算按公式(1)进行。

X=C×V/m

(1)

式中：X为芝麻素/芝麻林素/细辛素含量，mg/g；C为根据峰面积和标准曲线计算得到的芝麻素/芝麻林素/细辛素的质量浓度，mg/L；V为定容体积，L；m为取样质量，g。

1.2.5 数据分析

所有试验重复3次，结果以“平均值±标准差”表示，采用Excel和SPSS 19.0软件进行数据整理和分析。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件优化

2.1.1 甲醇用量的优化

本文参考文献[7,9]选择甲醇作为提取溶剂。按1.2.3方法，取样品0.1 g，分别用5、10、15 mL甲醇进行提取，提取次数为3次，涡旋时间2 min，超声时间10 min，然后按1.2.4方法检测芝麻素、芝麻林素和细辛素含量，结果如表1所示。

表1 甲醇用量对芝麻素、芝麻林素和细辛素检测结果的影响

由表1可以看出：甲醇用量由5 mL增加至10 mL时，芝麻素的检测结果显著增加(p<0.05)；甲醇用量由10 mL增加至15 mL时，芝麻素检测结果并没有显著差异(p>0.05)；不同甲醇用量的芝麻林素和细辛素的检测结果差异不显著(p>0.05)。因此，选择甲醇用量为10 mL。

2.1.2 超声时间的优化

超声辅助提取法是利用超声过程产生的强烈振动、高加速度和空化作用，促使目标物进入提取溶剂中，以缩短提取时间、节省提取溶剂的一种提取方法，因此本文利用超声辅助提取芝麻油中的芝麻素、芝麻林素和细辛素。

按1.2.3方法，取样品0.1 g，用10 mL甲醇提取3次，涡旋时间2 min，固定超声时间分别为2、6、10、14 min，然后按1.2.4方法检测芝麻素、芝麻林素和细辛素含量，结果见表2。

由表2可知，超声时间延长，芝麻素、芝麻林素和细辛素检测结果并没有显著差异(p>0.05)，说明超声时间对芝麻素、芝麻林素和细辛素检测结果影响不大，故选择最短超声时间2 min。

表2 超声时间对芝麻素、芝麻林素和细辛素检测结果的影响

2.2 检测方法的考察

2.2.1 标准曲线、线性范围和检出限

将芝麻素、细辛素和芝麻林素单个标准溶液进行HPLC分析，结果表明，芝麻素、细辛素和芝麻林素的出峰时间分别为8.56、9.70、11.00 min。再将配制好的标准工作液空白以及处理好的样品进行HPLC分析，得到色谱图如图1所示。

图1 HPLC谱图

由图1可以看出，芝麻素、芝麻林素和细辛素样品与标准品有相同的滞留时间，且色谱峰杂峰少、峰型良好、分离度良好，因此可确认样品具有芝麻素、芝麻林素和细辛素。

以峰面积(y)为纵坐标，对应质量浓度(x)为横坐标绘制标准曲线，根据信噪比确定检出限(LOD)(S/N=3)以及定量限(LOQ)(S/N=10)，结果如表3所示。

表3 芝麻素、芝麻林素和细辛素的标准曲线、相关系数、线性范围、检出限和定量限

由表3可以看出，芝麻素、芝麻林素和细辛素标准曲线的相关系数分别为0.999 5、0.999 6和0.999 2，表明芝麻素、芝麻林素、细辛素分别在4～100 mg/L、4～100 mg/L和1～40 mg/L的范围内线性良好。芝麻素、芝麻林素和细辛素的检出限和定量限分别为0.03、0.02、0.02 mg/g和0.06、0.06、0.04 mg/g。检测结果若小于检出限则记录“未检出(ND)”；若大于检出限但小于定量限则记录“检出”；若大于定量限则记录具体数值。

2.2.2 加标回收率

向已知木脂素含量的芝麻油中分别加入低、中、高3个浓度的木脂素标准品溶液，按照1.2.3方法进行处理，按1.2.4方法进行测定。每个加标水平重复3次，并重复进行3 d，计算相应的加标回收率，结果如表4所示。

表4 芝麻素、芝麻林素和细辛素的加标回收率(n=3)

由表4可知：连续3 d芝麻素的回收率为87.17%～92.59%，芝麻林素的回收率为92.71%～102.24%，细辛素的回收率为95.66%～108.93%；相对标准偏差(RSD)均小于5%，符合加标水平大于1 mg/kg加标回收率为80%～110%的规范，说明本方法具有良好的准确性。

2.2.3 精密度

取同一样品，按1.2.3方法进行处理，按1.2.4方法进行测定，重复分析6次，并重复进行3 d，重复分析6次，计算相对标准偏差(RSD)，结果如表5、表6所示。

表5 芝麻素、芝麻林素和细辛素日内精密度试验结果(n=6)

由表5、表6可以看出，芝麻素、芝麻林素和细辛素的日内精密度(RSD)分别为0.72%、1.50%和1.35%，日间精密度(RSD)分别为0.53%、1.69%和1.16%，RSD均小于2%。检测范围落在品质范围内，可信度佳，说明本方法对芝麻油中芝麻素、芝麻林素和细辛素含量的分析具有良好的精密度和重复性。

表6 芝麻素、芝麻林素和细辛素日间精密度试验结果(n=6)

2.2.4 不同人员间对比

为了进一步验证方法的稳定性，对同一芝麻油的木脂素含量进行了人员对比分析。重复分析6次，并连续进行3 d，结果如表7所示。由表7可知，不同人员对同一样品的芝麻素、芝麻林素和细辛素检测结果的相对标准偏差小，芝麻素的相对标准偏差为1.10%～1.35%，芝麻林素的相对标准偏差为0.51%～1.68%，细辛素的相对标准偏差为2.05%～3.50%，均不超过4%。进一步验证了方法的精确性。

表7 不同人员对比试验结果

2.2.5 与有资质的质检部门检测结果比对

有CNAS资质的质检部门检测芝麻木脂素所用方法为GB/T 31579—2015 《粮油检验 芝麻油中芝麻素和芝麻林素的测定 高效液相色谱法》，而国标方法仅检测芝麻素和芝麻林素两个组分。因此，将本方法检测芝麻素和芝麻林素的结果与有资质的质检部门检测结果进行比对，样品由本实验室提供，共提供5个芝麻油样品进行检测，结果如表8所示。

表8 实验室自检与有资质的质检部门结果对比

由表8可知，两方法对芝麻素检测结果的相对标准偏差为0.00%～7.41%，对芝麻林素检测结果的相对标准偏差为3.43%～7.04%，均小于10%。因此，该检测结果再现性良好。

2.3 芝麻油样品测定

采用本方法检测购自本地超市的各芝麻油样品中木脂素的含量，结果如表9所示。

表9 不同芝麻油样品中芝麻素、芝麻林素和细辛素的含量(n=3) mg/g

由表9可知，各芝麻油样品中均检测到芝麻素和芝麻林素，且芝麻素含量均大于芝麻林素含量。样品中芝麻素含量范围为2.70～6.28 mg/g；芝麻林素含量范围为0.97～3.15 mg/g；细辛素含量范围为ND～0.46 mg/g。芝麻素和芝麻林素是芝麻籽粒本身就存在的两种木脂素，其含量与芝麻品种、产地以及芝麻油的加工工艺有关[23-25]。细辛素为芝麻油加工过程中转化而成，芝麻油加工过程中经过高温炒籽、磷酸水化脱胶和活性白土吸附脱色等工序可能使芝麻素异构化形成细辛素[4]。因此，样品中各木脂素含量不同，与芝麻的来源和芝麻油的加工工艺有关。

2.4 本方法与国标方法的差异

本研究方法与国标方法(GB/T 31579—2015)的差异见表10。

表10 本研究方法与国标方法的比较

由表10可见：本研究方法检测组分比国标方法多；且样品前处理方法的原理与国标方法不同，国标方法是利用氨基固相萃取柱和硅胶固相萃取柱串联对目标物进行萃取、净化和富集，样液流过固相萃取柱时木脂素被吸附，甘油三酯等干扰物质流出，再将木脂素洗脱下来从而达到分离净化的目的，而本研究方法以甲醇为提取溶剂，利用木脂素在甲醇与油脂中溶解度的不同进行提取；本研究方法所用试剂、耗材的种类和数量比国标方法少，大大降低了检测成本，且本研究方法前处理耗时短。

3 结 论

本文优化了甲醇提取芝麻油中芝麻素、芝麻林素和细辛素的条件，经方法学验证，芝麻素、芝麻林素和细辛素线性关系良好，相关系数分别为0.999 5、0.999 6和0.999 2。本方法重复性好、精密度高，加标回收率在87.17%～108.93%之间。本方法可分析芝麻油中芝麻素、芝麻林素和细辛素，且操作简单、耗时短、检测成本低，可应用在快速、准确定性和定量芝麻油中芝麻素、芝麻林素和细辛素含量的检测分析。