母乳中1-油酰基-2-棕榈酰基-3-亚油酰基甘油三酯的研究进展

2022-05-31余晓雯赵军英胡聚峰杨轶涵陈历俊

中国油脂 2022年5期

余晓雯，刘茜，刘妍，赵军英，胡聚峰，李莹，杨轶涵，陈历俊

(1.东北农业大学食品学院，哈尔滨150030； 2.北京三元食品股份有限公司国家母婴乳品健康工程技术研究中心，北京市乳品工程技术研究中心，母乳研究技术创新中心，北京 100163)

母乳中的成分高达2 000多种，含有大量婴幼儿生长发育必不可少的营养物质[1]。脂质作为母乳中婴幼儿最重要的营养物质之一，在母乳中占3%～5%，为0～6个月内的婴儿提供40%～50%的能量，参与婴幼儿多个器官快速生长[2]，对婴幼儿胃肠道功能[3]、身体发育、神经系统发育[4]和免疫系统发育[5]等具有有益影响。

甘油三酯(TAG)是母乳脂质中含量最高的成分，约占全部脂质的98%。母乳脂质中，超过70%的棕榈酸位于TAG甘油骨架sn-2位[6-7]，其他的不饱和脂肪酸(UFA)，如油酸和亚油酸大部分位于TAG甘油骨架sn-1,3位。棕榈酸在甘油三酯sn-2 位具有促进婴幼儿对钙等矿物质的吸收[8-9]、软便的形成，缓解婴幼儿哭闹[10]等效果。母乳脂质中TAG多以USU形式存在[11-12]，其中1,3-二油酰基-2-棕榈酰基甘油三酯(1,3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol, OPO)和1-油酰基-2-棕榈酰基-3-亚油酰基甘油三酯(1-oleoyl-2-palmitoyl-3-linoleoylglycerol, OPL)为母乳中含量最丰富的两种TAG。研究表明，不同国家和地区的母乳中OPL与OPO的含量存在差异，主要表现为中国母乳中OPL含量普遍高于OPO含量，而欧美国家恰恰相反。当前市售的婴幼儿配方奶粉脂质在脂肪酸种类上与母乳脂质没有明显差异，但在脂肪酸含量和TAG甘油骨架位置上仍有较大区别，添加到婴幼儿配方奶粉中的植物油在sn-2位上的棕榈酸水平较低，相反，其在sn-1,3位上有较高水平[13]，如Sun等[14]通过测定180个市售婴幼儿配方奶粉脂质，发现配方奶粉脂质TAG结构和含量与成熟期的母乳脂质有显著差异，且配方奶粉脂质中OOO含量较为丰富；Chen等[15]通过分析市售标有添加OPO婴儿配方奶粉脂质的TAG组成发现，婴儿配方奶粉中除了含有OPO，也存在一定比例的PPO。目前，我国婴幼儿配方奶粉多是通过添加OPO来模拟母乳脂质，这与中国母乳脂质TAG组成不完全相同。为进一步研究OPL对婴幼儿生长发育的影响，本文对母乳中OPL的功能、不同国家和地区母乳中OPL含量及检测方法进行阐述，以期为结合中国母乳特征开发更适宜中国婴幼儿的人乳替代脂提供参考。

1 母乳中OPL的功能

母乳脂质在婴儿发育方面具有重要意义，其TAG的脂肪酸组成和含量对一些代谢调节有影响[16-17]。OPL化学结构中sn-2位为饱和脂肪酸(SFA)棕榈酸，sn-1位和sn-3位为UFA。母乳中OPL在胃肠道被脂肪酶水解成sn-2单甘油酯和游离脂肪酸，在婴幼儿的营养物质吸收、骨骼生长以及肠道菌群的正常发展等方面发挥重要作用[18]。

Bar-Yoseph等[19]在一项双盲实验中发现sn-2位棕榈酸对婴幼儿粪便中脂肪和钙的含量存在影响，喂养含有sn-2位棕榈酸配方奶粉的婴幼儿相较于普通婴幼儿配方奶粉组，粪便中脂肪含量明显较低，减少了钙皂化脂肪的排泄。Béghin等[20]实验证明，棕榈酸在sn-2位能改善婴幼儿粪便的黏稠度以及提高骨骼矿物质含量，这是由于处在sn-2位的棕榈酸不易与钙离子结合形成不溶性钙皂，进而改善便秘和促进钙的吸收。Litmanovitz等[21]也进一步证明sn-2位为棕榈酸的结构脂能改善婴儿粪便硬度，减少便秘，并且能降低婴儿啼哭频率。Wang等[22]研究发现喂养sn-2位棕榈酸结构脂小鼠对钙的吸收率约48.45%，高于喂养混合植物油组(代表传统婴幼儿配方奶粉)的小鼠(38.43%)，还发现这类结构脂可以诱导小鼠肠道内的双歧杆菌和乳酸杆菌的增殖，减少致病菌的数量，这与Yaron 等[23]的研究结果一致：以母乳和sn-2位棕榈酸甘油酯组喂养的婴儿肠道菌群中乳酸杆菌和双歧杆菌增加。

油酸和亚油酸作为母乳中主要的脂肪酸，为乳脂肪球的形成、运输和代谢提供了流动性[24]。早期对以油酸和亚油酸为主的饮食研究显示，与油酸相比，婴儿饮食以亚油酸为主的多不饱和脂肪酸(PUFA)似乎更能降低胆固醇水平[25]。但其他研究中提到，亚油酸的过量摄入与非典型神经发育有关[26]。Oosting等[27]研究发现，婴儿摄入母乳或奶粉中的亚油酸和α-亚麻酸会影响大脑中n-3和n-6 PUFA的合成，这两者之间存在竞争关系，亚油酸摄入过高可能会抑制内源性n-3 PUFA的合成和循环，会对婴幼儿大脑产生一定的影响。在近年来的规范中，许多国家都有调整婴幼儿配方奶粉中亚油酸的比例，但也强调这还需要更多临床上的证据来支持[28]。

也有通过体外对比研究，分析OPL的功能，如Zhang等[29]采用OPL、OPO和1，3-二亚油酰基-2-棕榈油基甘油三酯(LPL)来体外模拟婴儿胃肠道对脂质的代谢，发现OPL和LPL的消化率均低于OPO，推测原因：一是OPO的粒径比OPL和LPL小，与酶接触面积大且油酸与胰酶结合能力强，更易从油滴表面脱落；二是双键阻碍了与酶结合。另外，实验还采用Caco-2细胞模拟TAG在小肠上皮细胞的合成和分泌，结果显示在Caco-2细胞中OPL、LPL的合成和运输高于OPO，这与OPL组中FABP1、PPARα和MTT蛋白的表达显著高于OPO组有关，表明OPL更利于吸收和运输。此外，该团队[30]进一步考察了在体外肝细胞(LO2细胞)中OPL、LPL和OPO对脂质代谢的影响，结果表明，尽管OPL、LPL和OPO均能改变参与脂质代谢关键蛋白的表达，进而引起脂质在肝细胞代谢的变化，但是OPL相对于LPL和OPO更容易引起LO2细胞内脂质的堆积，但这是否有利于婴幼儿的生长和发育还需进一步验证。

目前临床研究缺少直接对婴幼儿喂养OPL含量高的母乳或婴幼儿配方奶粉的数据，并且OPL在制备上也存在着诸多困难，因此如何解决OPL制备过程中的酰基迁移和操作复杂等问题还需要不断研究[31-32]。而目前只从脂肪酸对比和体外研究来分析OPL对婴幼儿生长发育的影响，还需要考虑其他因素的干预或影响。

2 不同国家和地区母乳中OPL含量

不同的生活环境、饮食习惯等，导致不同地区母亲分泌的乳汁有所差异[33]。表1列举了不同国家和地区的母乳脂质中OPL和OPO的含量。

表1 不同国家和地区母乳脂质中OPL和OPO的含量

Morera[34]、Pons[35]等利用HPLC-ELSD分析了西班牙47个不同哺乳时期的母乳脂质中TAG组成，共分离出30种TAG，得出OPL含量低于OPO(OPO含量为17.56%～42.44%，OPL含量为9.24%～38.15%)。Ten-Doménech等[36]收集了西班牙巴伦西亚地区不同阶段的母乳，采用HPLC-ELSD对母乳中脂质TAG组成进行分析，得出OPO含量约为20%，OPL含量约为10%。Kallio等[37]对芬兰和中国母乳样本进行分析，通过HPLC-MS在电喷雾(ESI)离子源检测下，得到数百个TAG的同分异构体，发现芬兰母乳脂质中含量较高的TAG是OPO(9.4%)，其次是OPL(5.4%)，而中国母乳脂质含量较高的TAG是OPL(10.3%)，OPO(7.1%)次之，该研究还指出油酸通常在TAG的sn-1,3位，但当存在亚油酸则油酸不一定在sn-1, 3位。

Wu等[38]采用HPLC/串联四级杆-飞行时间质谱(Q-TOF-MS)并使用ESI离子源测定52份北京地区母乳脂质脂肪酸和TAG的组成和含量，结果发现，北京地区母乳脂质中油酸与亚油酸的含量与母亲饮食中的豆类、海鲜及坚果等有关，OPL含量在10.31%～14.17%之间，而OPO含量为7.29%～11.91%。Zhang等[39]使用超高效合相色谱UPC2/Q-TOF-MS测定无锡地区母乳样品，结果发现，母乳脂质中OPL含量为12.60%～19.35%，占总TAG的10.82%，OPO含量为7.98%～17.06%，占总TAG的8.80%。Zhao等[40]研究北京地区的母乳脂质TAG含量，采用UPLC/Q-TOF-MS在ESI正负离子检测模式下分析得出OPL、OPO含量分别为14.09%和12.80%，且研究表明棕榈酸主要分布在母乳TAG的sn-2位。

Tu等[41]利用超临界流体色谱(SFC)结合Q-TOF-MS分析，检测了湖北、四川和北京3个地区54份母乳脂质TAG的组成和含量，结果表明：湖北、北京和四川3个地区过渡乳与成熟乳TAG种类存在差异；但是无论过渡乳还是成熟乳，OPL含量皆高于OPO含量，且过渡乳中OPL含量高于成熟乳的OPL含量。Yuan等[42]利用HPLC-MS配备大气压化学电离(APCI)离子源研究分析无锡地区103位母亲初乳到成熟乳TAG组成的变化，结果发现3个时期母乳脂质的脂肪酸谱存在显著差异；OPO在初乳、过渡乳和成熟乳的脂质中含量分别为19.50%、14.09%和13.91%，始终低于OPL含量(分别为28.08%、23.24%和24.98%)。

通过比较不同国家、不同地区以及不同泌乳期母乳中OPO和OPL的含量(不区分异构体)发现，中国母乳中OPL含量高于OPO[43]，这与欧美国家恰好相反，而且中国母乳中油酸与亚油酸的比例也低于欧美国家[44-45]。从饮食方面分析认为，欧美多数国家日常摄入奶酪、黄油及橄榄油等低碳水、高脂肪的食物[46]，是母乳脂质中油酸含量高于中国的因素之一。而中国人群大多数食用的植物油(如大豆油、葵花籽油等)亚油酸[45-48]含量高，且豆制品的摄入也可以提高母乳脂质中亚油酸的含量[49]。因此，饮食习惯可能是中国母乳脂质中OPL含量高于OPO的重要原因之一。另外，3个泌乳期中，成熟乳中OPL含量相对较低。

3 母乳中OPL的检测方法

根据脂肪酸在甘油骨架sn-2位和sn-1, 3位酯化位置不同而产生位置异构体或称为区域异构体(TAG碳链上脂肪酸位置不同，而非脂肪酸链上双键位置差异)。此外，不同的脂肪酸酯化在甘油骨架sn-1位和sn-3位会具有旋光活性，导致对映异构体[50]。OPL和OPO作为母乳中含量最高的两种TAG，其主要的对映异构体被证明为rac-OPL(指外消旋后OPL中包含OPL和LPO两种结构脂)和rac-OPO[37]。现有的检测方法普遍是对乳中总TAG的检测，得出乳中OPL的含量，一般不区分脂肪酸在甘油骨架上的位置。目前有研究结合生物法即添加脂肪酶对TAG特定位置的酯键进行水解后再进行测定，该方法在OPO的检测中较为成熟，因为胰脂肪酶能直接水解sn-1，3位脂肪酸，并能对sn-2位进行确定。有研究显示，胃脂肪酶对TAG的sn-3位有一定的特异性[51]，能水解得到sn-3位脂肪酸。但是通过胃脂肪酶水解OPL建立检测方法并没有得到应用，原因可能是胃脂肪酶对中短链脂肪酸的水解活性强于长链脂肪酸[52-53]。

早在1988年就有研究采用GC分析TAG，如玻璃毛细管、熔融二氧化硅毛细管等对TAG定量分析[54]。但该方法的缺点是带有PUFA的TAG极易在检测中损失，因此该方法逐渐被淘汰。目前，无论是气相色谱法还是液相色谱法都会结合质谱进行测定，从而得到更准确的结果，如气相色谱质谱联用(GC-MS)以及超高效液相色谱质谱联用(UPLC-MS)等[55]。质谱可以通过准分子离子的准确质量分别精确计算TAG和甘油二酯(DAG)的分子式，并通过片段离子[M+H-FA]+推导出甘油骨架上的脂肪酸酰基。在TAG中，sn-1，3位的脂肪酸酰基比sn-2位的更容易断裂，并产生不同丰度的[M+H-FA]+[56]，因此可通过碎片的强度初步确定脂肪酸在甘油骨架上的位置。近年来，对OPL的位置异构体和对映异构体的分离开始采用银离子高效液相色谱(Ag+-HPLC)或带有手性色谱柱的液相色谱法分离，再结合带有大气压化学电离离子源的质谱(APCI-MS)对分离的样品进行检测，结果表明TAG的异构体在一定条件下能被明显表示，而且采用化学电离能规避电子碰撞电离在识别上的问题。

Kurvinen等[57]采用化学电离质谱法测定脂肪酸在TAG中相对分子质量分布，采用碰撞诱导解离串联质谱法确定母乳和母乳替代品中脂肪酸在TAG中sn-2位和sn-1，3位的分布。Zou等[58]用Ag+-HPLC和手性高效液相色谱分别与APCI-MS联用，对母乳脂质中TAG位置异构体和对映异构体(rac-OOP/rac-OPO)进行了分离和鉴定，但其他重要的TAG如1-月桂酰基-2,3-二油酰基甘油三酯(LaOO)和OPL的位置异构体尚未分离。Nagai等[59]采用手性高效液相色谱法实现了TAG位置异构体与对映异构体的分离，采用Chiralpak IF-3 色谱柱同时分离POL、SOL(1-硬脂酸-2-油酸-3-亚油酸甘油三酯)和PSO(1-棕榈酸-2-硬脂酸-3-油酸甘油三酯)混合TAG，联合带有ESI的质谱对其进行分析，采用乙腈作为流动相(可以减少峰拖尾，原因是乙腈增加了流动相的极性和密度)，可以识别sn-1位和sn-3位的UFA(O或L)，但是对OPL、LOP、PLO混合物不能完全分离。

张兰威等[60]设计了一种母乳中rac-OPL对映异构体的检测方法。提出先对母乳中OPL进行靶向收集，即采用连有C18色谱柱的液相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定、收集；其次，利用带有手性色谱柱(Lux Cellulose-1手性色谱柱)的液相色谱-大气压化学电离质谱(HPLC-APCI-MS)对收集的OPL进行测定。结果发现，rac-OPL的峰得到明显的分离。该团队[61]在之前的实验中分别用带有银离子色谱柱和手性色谱柱HPLC-APCI-MS对母乳中主要TAG进行了位置异构体和对映异构体分析，得出了rac-OPL以及其对映异构体的相对含量，但对于rac-OPL、rac-POL、rac-PLO混合物的分离仍存在困难，且母乳中也存在基线未分开的情况。

综上，检测OPL的方法通常分为两个步骤：分离和鉴定。常见的如高效液相色谱法能测出母乳中OPL含量，但是在结构上不能得到良好的鉴定。手性色谱法和银离子色谱法已经被用于TAG的分析，但对于母乳中OPL的检测报道较少。Ag+-HPLC分离原理是固定相中的银离子与TAG中双键的π电子之间的电荷转移作用分离TAG，双键数目及位置决定保留时间[62]；而分析TAG的手性色谱柱的填充物一般多采用纤维素或环状糊精的衍生物，对对映异构体具有选择性[63]。Ag+-HPLC /APCI-MS可以分离TAG的位置异构体但不能分离对映异构体，而手性色谱柱可以解决这一问题，所以实验中可以通过两种方法来达到OPL的分离鉴定。目前已经确定rac-OPL能进行分离，但由于母乳样品的复杂性，分离效果达不到rac-OPL标准品的效果。也有学者提出使用一种新型算法[64]对油脂中的AAB型和ABC型TAG的异构体进行检测，其原理是TAG通过质谱中碎片离子的响应强度制作校正曲线对样品中的TAG异构体进行定量，但该方法目前没有运用于母乳检测中，而且该方法只区分TAG的位置异构体。所以，未来针对母乳的测定方法还需要探索，并且需要不断优化条件以区分更多的脂质物质。