3，4-二羟基苯乙酮调控JNK/Nrf2信号通路减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤的作用研究*

曹黛虹， 王韵涵， 张代娟， 刘江月

（潍坊医学院病理生理教研室，山东 潍坊 261053）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种由多种危险因素引起的发病机制复杂的慢性血管疾病，是心脑血管疾病死亡的主要原因［1］。目前认为，血管内皮损伤是AS 主要发病机制之一。研究表明，内皮细胞损伤是AS 发生的始动环节，氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）可刺激内皮细胞，导致氧化应激和炎症反应，是致内皮细胞损伤的关键因子［2］。因此，减轻或抑制ox-LDL 诱导的内皮细胞损伤对AS的防治具有重大意义。

核因子E2 相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反应元件（antioxidant responsive element，ARE）信号通路被认为是重要的内源性抗氧化应激通路，在机体抗AS 形成的过程中发挥重要作用。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）家族的一员，可被多种应激信号激活，识别抗氧化调控因子Nrf2 并激活Nrf2/ARE 信号通路［3］。研究表明，Nrf2 受到上游调节激酶，如Akt 或MAPKs 的调节，小檗碱可激活Akt和MAPKs信号，诱导Nrf2介导的抗氧化酶NAD（P）H醌 脱 氢 酶1［NAD（P）H quinone dehydrogenase 1，NQO1］的表达［4］；黄连碱激活Akt 和JNK/Nrf2/NQO1通路减轻AAPH 诱导的氧化应激［5］。3，4-二羟基苯乙酮（3，4-dihydroxyacetophnone，3，4-DHAP）是从秃毛冬青叶中提取的有效单体成分，具有抗炎、抗氧化、扩张冠脉等多种药理活性［6-8］。前期研究结果显示，3，4-DHAP 能够抑制NF-κB 核转位减轻脂多糖诱导巨噬细胞炎症反应，抑制ApoE-/-小鼠AS 斑块的形成。本研究拟进一步观察3，4-DHAP 对ox-LDL 诱导的EA.hy926 细胞损伤的影响，并从JNK/Nrf2 信号通路角度探讨其可能的作用机制。

材料和方法

1 材料与仪器

1.1 细胞株 源自ATCC 的人脐静脉内皮细胞株EA.hy926购于上海拜力生物科技有限公司。

1.2 药物与试剂 3，4-DHAP（纯度99.9%；TCI）；一氧化氮（nitric oxide，NO）和内皮素1（endothelin-1，ET-1）试剂盒，以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）和超氧化物歧化酶（superoxide dismuctase，SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；MTT试剂盒、TUNEL 检测试剂盒、Western blot 相关试剂及RT-qPCR 试剂盒（碧云天生物技术研究所）；Nrf2、JNK、p-JNK 和血红素加氧酶1（hemo oxygenase-1，HO-1）抗体（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 主要仪器 DYCN-25D 型电泳仪（北京市六一仪器厂）；激光共聚焦显微镜（Olympus）；752 型紫外分光光度计（上海精密仪器有限公司）；T100 型梯度PCR仪、转膜仪和凝胶成像分析仪（Bio-Rad）

2 方法

2.1 实验分组及干预方法 根据文献［4-6］确定ox-LDL 及3，4-DHAP 的剂量并建立ox-LDL 诱导的EA.hy926 细胞氧化应激模型。将生长良好的EA.hy926细胞随机分为空白对照（control，CON）组、3，4-DHAP（0.1 mmol/L）对照（3，4-DHAP control，3，4-DHAP-C）组、ox-LDL（100 mg/L）组、ox-LDL+低剂量（0.01 mmol/L）3，4-DHAP（low-dose 3，4-DHAP，3，4-DHAP-L）组和ox-LDL+高剂量（0.1 mmol/L）3，4-DHAP（high-dose 3，4-DHAP，3，4-DHAP-H）组。3，4-DHAP-C 组、ox-LDL+3，4-DHAP-L 组和ox-LDL+3，4-DHAP-H 组分别加入不同浓度3，4-DHAP 孵育24 h后，弃培养液；ox-LDL 组、ox-LDL+3，4-DHAP-L 组和ox-LDL+3，4-DHAP-H 组再加入终浓度100 mg/L 的ox-LDL培养24 h，进行后续实验。

2.2 ROS 生成检测 处理后的细胞加入无血清培养基稀释的DCFH-DA（1∶1 000），37 ℃孵育30 min。488 nm激光激发，激光共聚焦显微镜观察。

2.3 SOD、NO 和ET-1 水平的检测 收集培养液上清，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD 活力，硝酸还原酶法测定NO 浓度，ELISA 法测定ET-1水平。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

2.4 CCK-8 法检测细胞活力 加入CCK-8 反应液，继续培养4 h 后，用酶标仪450 nm 测定吸光度（A）。细胞活力（%）=（A实验孔-A空白孔）/（A对照孔-A空白孔）×100%。

2.5 TUNEL法检测细胞凋亡情况 4%多聚甲醛固定细胞30 min，按照TUNEL检测试剂盒说明书操作，染色结束后将细胞置于倒置荧光显微镜下观察拍照计数。细胞凋亡率（%）=（凋亡的细胞数/细胞总数）×100%。

2.6 RT-qPCR 检测Nrf2 和HO-1 mRNA 表达 收集细胞提取总RNA，按试剂盒操作说明合成cDNA，以GAPDH 为内参照，进行PCR 扩增，设计的引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

2.7 Western blot 检测JNK、p-JNK、Nrf2 和HO-1 蛋白水平 收集细胞分别提取总蛋白及核蛋白，SDSPAGE 分离蛋白后转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后加Ⅰ抗（1∶500），4 ℃孵育过夜，TBST 振荡洗涤3 次后，Ⅱ抗37 ℃孵育1 h，TBST 振荡洗涤4 次后，ECL 发光显色，凝胶成像系统扫描分析。

3 统计学处理

采用SPSS 18.0软件分析。计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 3，4-DHAP 对ox-LDL 诱 导 的EA. hy926 细 胞ROS生成及SOD活性的影响

与CON 组比较，3，4-DHAP-C 组ROS 无显著变化（P＞0.05），SOD 活性略有升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），ox-LDL 组、ox-LDL+3，4-DHAP-H 组和ox-LDL+3，4-DHAP-L 组ROS 生成均显著增加，而SOD 活性均显著下降（P＜0.05）；与ox-LDL 组比较，ox-LDL+3，4-DHAP-H 组 和ox-LDL+3，4-DHAP-L 组ROS 生成均显著降低，而SOD 活性显著升高；与ox-LDL+3，4-DHAP-L 组比较，ox-LDL+3，4-DHAP-H 组ROS生成显著降低，而SOD活性显著升高（P＜0.05），见图1。

2 3，4-DHAP 对ox-LDL 诱 导 的EA. hy926 细 胞NO和ET-1的影响

与CON 组比较，3，4-DHAP-C 组NO 和ET-1 水平均无显著变化（P＞0.05），ox-LDL 组、ox-LDL+3，4-DHAP-H 组和ox-LDL+3，4-DHAP-L 组NO 生成均显著减少，而ET-1 生成显著增加（P＜0.05）；与ox-LDL组比较，ox-LDL+3，4-DHAP-H 和ox-LDL+3，4-DHAPL 组NO 生成均显著增加，而ET-1 生成显著减少（P＜0.05）；与ox-LDL+3，4-DHAP-L 组比较，ox-LDL+3，4-DHAP-H 组NO 生成显著增加，而ET-1生成显著减少（P＜0.05），见图2。

3 3，4-DHAP 对ox-LDL 诱导的EA. hy926 细胞活力和凋亡的影响

与CON组比较，3，4-DHAP-C组细胞活力和凋亡情况均无显著变化（P＞0.05），ox-LDL 组、ox-LDL+3，4-DHAP-H 组和ox-LDL+3，4-DHAP-L 组细胞活力均显著降低（P＜0.05），凋亡率显著升高（P＜0.05）；与ox-LDL 组比较，ox-LDL+3，4-DHAP-H 组和ox-LDL+3，4-DHAP-L组细胞活力均显著增强（P＜0.05），凋亡率显著降低（P＜0.05）；与ox-LDL+3，4-DHAP-L 组比较，ox-LDL+3，4-DHAP-H 组细胞活力显著增强（P＜0.05），凋亡率显著降低（P＜0.05），见图3。

4 3，4-DHAP 对ox-LDL 诱 导 的EA. hy926 细 胞Nrf2和HO-1 mRNA表达的影响

与CON 组比较，3，4-DHAP-C 组Nrf2 和HO-1 的mRNA 表达略有升高，但差异均无统计学意义（P＞0.05），ox-LDL 组、ox-LDL+3，4-DHAP-H 组 和ox-LDL+3，4-DHAP-L 组Nrf2 和HO-1 的mRNA 表达均显著减少（P＜0.05）；与ox-LDL 组比较，ox-LDL+3，4-DHAP-H 和ox-LDL+3，4-DHAP-L 组Nrf2 和HO-1 的mRNA 表达均显著增高（P＜0.05）；与ox-LDL+3，4-DHAP-L组比较，ox-LDL+3，4-DHAP-H 组Nrf2和HO-1的mRNA表达均显著增高（P＜0.05），见图4。

5 3，4-DHAP 对ox-LDL 诱 导 的EA. hy926 细 胞JNK、p-JNK、HO-1和Nrf2蛋白水平的影响

与CON 组比较，3，4-DHAP-C 组Nrf2 和HO-1 蛋白表达及p-JNK/JNK 比值略有升高，但差异均无统计学意义，且Nrf2 核蛋白无显著变化（P＞0.05），ox-LDL 组、ox-LDL+3，4-DHAP-H 组 和ox-LDL+3，4-DHAP-L 组Nrf2 和HO-1 蛋白表达、p-JNK/JNK 比值及Nrf2 核蛋白表达均显著降低（P＜0.05）；与ox-LDL组比较，ox-LDL+3，4-DHAP-H 和ox-LDL+3，4-DHAPL 组Nrf2 和HO-1 蛋白表达、p-JNK/JNK 比值及Nrf2核蛋白表达均显著增高（P＜0.05）；与ox-LDL+3，4-DHAP-L组比较，ox-LDL+3，4-DHAP-H 组Nrf2和HO-1 蛋白表达、p-JNK/JNK 比值及Nrf2 核蛋白表达均显著增高（P＜0.05），见图5。

讨论

Figure 1. The effect of 3，4-DHAP on ROS generation（A）and SOD activity（B）in ox-LDL-treated EA. hy926 cells（scale bar=100 μm）. The results showed that the generation of ROS was significantly decreased and the activity of SOD was significantly increased in ox-LDL+3，4-DHAP-H group. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs ox-LDL group；&P＜0.05 vs ox-LDL+3，4-DHAP-L group.图1 3，4-DHAP对ox-LDL诱导的EA.hy926细胞ROS生成及SOD活性的影响

Figure 2. The effect of 3，4-DHAP on NO（A）and ET-1（B）production in ox-LDL-treated EA. hy926 cells. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs ox-LDL group；&P＜0.05 vs ox-LDL+3，4-DHAP-L group.图2 3，4-DHAP对ox-LDL处理的EA.hy926细胞NO和ET-1生成的影响

氧化应激致内皮细胞损伤是AS 的主要发病机制之一［9］。ox-LDL 与血凝素样ox-LDL 受体1 结合，促进ROS 大量生成，启动内皮细胞损伤和功能障碍的过程［10］，参与AS 的发生。ox-LDL 诱导的内皮细胞损伤是AS 发生的始动因素之一。因此，减轻或阻断ox-LDL 诱导的内皮细胞损伤将是预防和治疗AS 的有效途径之一。本研究结果进一步证实了ox-LDL可通过诱导氧化应激引起内皮细胞损伤。近年来学者们对3，4-DHAP 在心血管疾病中的应用进行了大量的研究，3，4-DHAP 可能通过AMP 活化蛋白激酶途径改善AS 时的病理性脂质代谢，预防和延缓AS的发生［11-12］。3，4-DHAP 还通过上调内皮型NO 合成酶-NO 信号通路，减轻氧化应激和炎症反应，纠正血管内皮功能失调［7，13］。这些研究提示，3，4-DHAP 是一种耐受性良好的天然化合物，具有良好的药理作用，可通过多靶点预防AS 的发生发展，为开发抗AS候选药物提供了实验依据。笔者一直致力于3，4-DHAP 抗AS 的研究［14-15］，本次以ox-LDL 诱导的EA.hy926 细胞为对象，观察到3，4-DHAP 可通过抑制ROS 的生成，使细胞活力增强，凋亡明显减少，增加了NO 的合成，降低了ET-1 的产生，从而减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤，证实了3，4-DHAP的抗氧化应激作用，并对抗氧化应激机制进行初步探索。

Figure 3. The effect of 3，4-DHAP on the apoptosis（A）and viability（B）of EA. hy926 cells induced by ox-LDL（scale bar=200 μm）. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs ox-LDL group；&P＜0.05 vs ox-LDL+3，4-DHAP-L group.图3 3，4-DHAP对ox-LDL诱导EA.hy926细胞凋亡和活力的影响

Figure 4. The effect of 3，4-DHAP on Nrf2（A）and HO-1（B）mRNA expression in EA.hy926 cells induced by ox-LDL. Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs ox-LDL group；&P＜0.05 vs ox-LDL+3，4-DHAP-L group.图4 3，4-DHAP对ox-LDL处理的EA.hy926细胞中Nrf2和HO-1 mRNA表达的影响

Figure 5. The effect of 3，4-DHAP on the protein levels of JNK，p-JNK，Nrf2，HO-1 and nuclear Nrf2 in EA.hy926 cells induced by ox-LDL. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs ox-LDL group；&P＜0.05 vs ox-LDL+3，4-DHAP-L group.图5 3，4-DHAP对ox-LDL诱导EA.hy926细胞JNK、p-JNK、Nrf2、HO-1及核内Nrf2蛋白水平的影响

在AS 发生发展的过程中，ROS 过量生成，抗氧化酶SOD、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS）等表达不足，氧化/抗氧化系统失调，从而引起氧化应激反应，造成内皮细胞损伤［16］。ROS 导致血管内皮细胞损伤是2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）大血管并发症发生的始动环节［17］。Nrf2 信号通路，是目前认为最重要的内源性抗氧化途径，是自我保护的重要转录因子。研究表明，激活Nrf2 可减轻T2DM 时Nrf2 失调致氧化应激介导的血管内皮损伤［17］。JNK是MAPKs家族的一员，Runchel 等［18］认为JNK 在保护细胞方面有两面性：短暂的低水平的ROS 不能持续激活JNK，此时激活的JNK 可促进Nrf2 磷酸化和核转移［19］，激活Nrf2/ARE 信号通路［20］，发挥抗炎、抗氧化及抗细胞凋亡等作用，表现出保护细胞的作用；而持续的高水平的活性氧持续激活JNK，此时激活的JNK 促进细胞凋亡。Rosaria 等［21］研究显示，原儿茶酸通过激活JNK/Nrf2 信号通路抑制ox-LDL 诱导的巨噬细胞凋亡。Feng 等［22］研究显示，柚皮苷通过激活JNK/Nrf2信号通路促进HO-1 表达，从而减轻高糖诱导的内皮细胞损伤。本研究也观察到，3，4-DHAP 可上调EA.hy926 细胞p-JNK/JNK 比值，促进Nrf2 核内移，上调HO-1 mRNA 及蛋白的表达，增强SOD 活性，抑制ROS生成，表明3，4-DHAP可能通过激活JNK/Nrf2信号通路，抑制氧化应激反应。

综上所述，3，4-DHAP 能够有效减轻ox-LDL 诱导的EA. hy926 细胞损伤，其机制可能与激活JNK/Nrf2 信号通路，抑制氧化应激反应有关。该研究结果为3，4-DHAP抗AS的开发应用提供可靠的实验依据。但ox-LDL 诱导的氧化应激与内皮细胞损伤的关系，以及其他通路在3，4-DHAP保护内皮细胞中的作用尚不明确，有待于今后的进一步研究。