柞蚕微孢子虫微管蛋白和孢壁蛋白基因在不同感染时期的表达水平分析

徐 欣 朱绪伟 刘中文 周其明 张永君 郭 剑

(河南省蚕业科学研究院，河南郑州 450008)

微孢子虫是一类专性寄生的单细胞生物，广泛寄生于脊椎和无脊椎动物，最先于家蚕体内发现，柞蚕微孢子虫是引起柞蚕微粒子病的病原物[1]。微管是细胞骨架的重要组成部分，也是纤毛、鞭毛等运动性器官及中心粒的重要组分[2]，组成微管的蛋白质称为微管蛋白，王勇[3]克隆得到了柞蚕微孢子虫α、β、γ-微管蛋白基因并进行了进化分析，发现前2种是系统发育分析的靶基因，而γ-微管蛋白对α、β-微管的装配、取向起着重要的调节作用。微管蛋白基因是一种持家基因(house-keeping genes)，又称管家基因，冷赫[4]曾用β-微管蛋白基因作为蝗虫微孢子虫的持家基因，来检测蝗虫微孢子虫孢壁蛋白的表达情况。

微孢子虫的生命周期有感染期、裂殖增殖期和孢子增殖期3个阶段[5]。孢子阶段是微孢子虫生活史中成熟的及具有侵染力的阶段，也是研究微孢子虫侵染机制、生活史及检测诊断的关键[6]。微孢子虫感染细胞途径认为主要有2种：一是孢子发射极丝注射孢原质到宿主细胞以达到感染的目的，有的同时形成寄生空泡再次感染[7]；二是通过微孢子虫孢壁的主要成分孢壁蛋白与宿主细胞的相互作用，来实现微孢子虫对宿主的侵染，孢壁蛋白也是病原体免疫检测的重要靶标蛋白[8]。孢壁蛋白在信号识别、细胞粘附和离子转运等方面起着重要作用，并被证实是病原菌侵染过程中的重要蛋白[9]，同时，还有研究发现微孢子虫孢壁的某些蛋白质被破坏，其孢子的感染能力显著下降[10]。

柞蚕微孢子虫是柞蚕病害防治中的重要检疫对象，其传播方式有水平传播与垂直传播，水平传播即经口感染，引发柞蚕各种生理机能障碍[11]。但是关于在水平传播关键时期，柞蚕微孢子虫是如何完成对柞蚕侵染的研究尚属空白；因此，本试验根据前人研究进展，选取柞蚕微孢子虫的α、β和γ-微管蛋白基因(GenBank登录号分别是KF154086、KF023271、KF740389)，以及3条孢壁蛋白NpSWP8、NpSWP35、NpSWP1基因(GenBank登录号分别是ABV48896.1、ABM30180.1、KJ573111)，共6条基因作为目的基因，在转录水平上研究微管蛋白基因、孢壁蛋白基因与柞蚕微孢子虫侵染的关系，找到侵染初期更灵敏的持家基因和检测基因，为后续进行柞蚕微孢子虫侵染相关分子机理的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试柞蚕品种 豫大一号，由河南省柞蚕育种研究室培育提供。

1.1.2 供试柞蚕微孢子 在柞蚕育种室柞蚕微粒子病镜检过程中，收集病娥，去翅和头部。柞蚕微孢子虫孢子的分离纯化采用姜义仁等[12]的Percoll密度梯度离心法。纯化后液氮速冻，-80 ℃保存备用。

1.1.3 主要试剂 动物组织总RNA提取试剂盒(RNAprep Pure Tissue Kit)、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒[FastQuant RT Kit(with gDNase)]、2×Taq PCR MasterMix、荧光定量PCR试剂盒[SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)]、琼脂糖、GeneGreen核酸染料、50×TAE Buffer(RT204)，均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.4 主要仪器设备 超微量紫外可见分光光度计(DS-11)，美国丹诺尔Denovix公司产品；高速冷冻离心机(TGL16M)，湖南湘立科学仪器有限公司产品；PCR仪(9200型)，Applied Biosystems公司产品；实时荧光定量PCR仪(CFX96)，美国伯乐(Bio-Rad)公司产品；紫外可见分光光度计(UV2600)，岛津仪器(苏州)有限公司产品；凝胶成像仪(1600)，上海天能科技有限公司产品；荧光定量平盖八排管(含盖)，购自PCRLABSELECT公司；恒温干燥箱(101-3S)，购自上海力辰仪器科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 柞蚕的微孢子虫人工感染 将纯化后的柞蚕微孢子虫用生理盐水稀释至2×107个/mL的孢子悬液。将稀释好的孢子悬液均匀喷洒到干净的柞树叶上，选取100头4龄起蚕进行添毒喂养，保证每头柞蚕食下的孢子数量为106个[13]，24 h后换成正常无毒柞树叶饲育。

1.2.2 柞蚕感染微孢子虫后中肠总RNA的提取以及cDNA的合成 在添食柞蚕微孢子虫后的4龄2 d、4 d、6 d的3个取样时间点，每个取样时间点随机选取10头柞蚕幼虫解剖出中肠作为样品，并进行样品混合，用液氮速冻，-80 ℃保存备用。用双蒸水(ddH2O)把研钵、剪刀、镊子等用具洗干净，放在恒温干燥箱内，160 ℃烘烤4 h备用。再使用动物组织总RNA提取试剂盒，按照其说明书的方法从感染柞蚕中肠中提取总RNA，提取的总RNA置于-80 ℃中保存备用。然后，按照FastQuant cDNA第一链合成试剂盒说明书的步骤将RNA反转录为cDNA，反转录的cDNA置于-20 ℃中保存备用。

1.2.3 引物设计 以各样品cDNA为模板进行PCR扩增，采用柞蚕肌动蛋白基因(Antheraea pernyi Actin，ApA)做阳性对照，对目的基因表达作差异性表达分析。用引物设计软件Primer Premier 5.0设计12对目的基因特异引物和2对ApA内参基因引物(表1)。其中ApA-A为半定量RT-PCR(Sq RT-PCR)所用的内参基因引物，ApA-B为实时荧光定量PCR(RT-qPCR)所使用的内参基因引物；其余目的基因的A、B分别表示Sq RT-PCR和RT-qPCR所用的引物。

表1 6种侵染相关基因及内参ApA基因的引物序列

1.2.4 基因表达量的半定量PCR分析 PCR反应体系：2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL，正向引物(10 μM)1 μL，反向引物(10 μM)1 μL，cDNA模板1 μL，添加焦碳酸二乙酯处理过并经高温高压灭菌的双蒸水(RNase-free ddH2O)至总体积25 μL。反应采用0.2 mL管在PCR仪上进行，反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s为1个循环，循环数为35，然后72 ℃延伸7 min。

PCR产物在TAE电泳缓冲液(将50×TAE试剂稀释成1×TAE电泳缓冲液)中，以1.2%琼脂糖凝胶电泳0.5 h，经GeneGreen染色后在凝胶成像系统下观察拍照。基因的相对表达水平以其PCR产物电泳条带和ApA基因PCR产物电泳条带的积分光密度(integrated optical density，IOD)比值表示。

1.2.5 Real Time qPCR检测 RT-qPCR的反应体系：2×SuperReal PreMix Plus(Probe)10 μL，正向引物(10 μM)0.6 μL，反向引物(10 μM)0.6 μL，cDNA模板1 μL，添加RNase-free ddH2O至总体积20 μL。RT-qPCR的反应程序：(1)预变性95 ℃ 15 min；(2)变性95 ℃ 10 s；(3)61 ℃ 1 min；(2)～(3)步40个循环(内参ApA基因为30个循环)。溶解曲线分析：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s。

1.2.6 标准曲线的制定 将cDNA样本稀释1倍、10倍、100倍、1 000倍、10 000倍，制定ApA基因和6个目的基因的标准曲线。用模板的稀释倍数的以2为底的log值对每个稀释样本的Ct值(即标准曲线y值)作图，两者呈线性递减关系。并优化Tm值、循环数等条件，保证qPCR反应的R2>0.98。

1.2.7 各基因表达量的荧光定量分析 以各种时期的cDNA为模板进行qPCR，ApA基因和6个目的基因均采用相同的PCR反应体系和反应程序，每个样本3次重复。根据标准曲线的Ct值，确定样本的稀释倍数，用荧光定量PCR试剂盒[SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)]测出Ct值，将该值代入相应的标准曲线，求出x值，然后再求该值的power以2为底的函数，将目的基因的结果与A3基因的结果求比值，得到该基因表达量的相对定量值。

1.3 数据处理与分析

所有的试验均重复3次，试验数据采用SAS 9.0数据分析软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 提取的RNA质量的鉴定

提取感染柞蚕微孢子虫后的4龄柞蚕中肠总RNA，利用紫外可见分光光度计测定RNA的纯度和浓度，A260/A280比值处于1.8～2.2之间，浓度>3 μg/μL，RNA质量满足反转录的要求。如图1所示，经1%琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性，结果核糖体RNA的几条主带28S、18S清晰可见。说明所抽提的RNA基本没有降解，能够进行反转录试验。

0为RNase-free ddH2O，Maker为2 000 bp DNA Marke；图2、图3同。1、2、3分别为4龄柞蚕2、4、6 d中肠的RNA。图1 甲醛变性凝胶电泳检测提取的感染微孢子虫后的4龄柞蚕中肠的RNA

2.2 反转录cDNA模板的检测

以4龄柞蚕2 d、4 d、6 d中肠的cDNA为模板，用ApA引物进行PCR扩增，PCR产物可电泳检测到468 bp的特异性条带(图2)，与PCR产物的理论分子量相符，证明合成的cDNA可以进行后续试验。

1、2、3分别为4龄柞蚕2 d、4 d、6 d中肠的cDNA。图2 ApA基因cDNA的PCR产物电泳图

1为α-微管蛋白基因，2为β-微管蛋白基因，3为γ-微管蛋白基因，4为孢壁蛋白NpSWP8基因，5为孢壁蛋白NpSWP35基因，6为孢壁蛋白NpSWP1基因；图4、图5同。图3 目的基因克隆的电泳图

2.3 目的基因的克隆与测序

根据各个引物最佳扩增条件，用感染柞蚕微孢子虫的4龄柞蚕中肠cDNA作为模板进行PCR。电泳结果显示，可特异性扩增出柞蚕微孢子虫α、β和γ-微管蛋白基因和孢壁蛋白NpSWP8、NpSWP35以及NpSWP1基因(图3)。测序结果显示，PCR产物的序列与各自已知的基因序列一致，说明设计的引物具特异性，可以进行后续的试验。

2.4 RT-qPCR标准曲线

根据RT-qPCR标准曲线的制定方法，制定到α、β和γ-微管蛋白基因和孢壁蛋白NpSWP8、NpSWP35以及NpSWP1基因的标准曲线。其中，ApA基因的标准曲线为y=-0.934 2x+38.526，R2=0.992 4(x表示以2为底稀释倍数的Log值，y表示Ct值，以下相同)；α-微管蛋白基因的标准曲线为y=-1.453 2x+39.928，R2=0.990 6；β-微管蛋白基因的标准曲线为y=-1.088 6x+34.956，R2=0.995 6；γ-微管蛋白基因的标准曲线为y=-1.292 3x+38.621，R2=0.983 1；孢壁蛋白NpSWP8基因的标准曲线为y=-1.246 6x+38.073，R2=0.992 5；孢壁蛋白NpSWP35基因的标准曲线为y=-1.192 7x+39.330，R2=0.982 2；孢壁蛋白NpSWP1基因的标准曲线为y=-1.240 4x+32.731，R2=0.994 6。扩增效率均大于94%，R2均大于0.97，与最优条件相近，可以采用。

2.5 4龄柞蚕感染柞蚕微孢子虫后不同发育时期侵染相关基因表达量的变化

在柞蚕4龄起蚕后添食柞蚕微孢子虫，选取感染初期的3个时间点4龄2 d、4 d、6 d来检测。由图4的半定量RT-PCR分析结果可以看出，在添食柞蚕微孢子虫后，与4龄2 d表达量对比，在4龄4 d的时间，3种微管蛋白基因和3种孢壁蛋白基因的表达量都先呈现显著或者极显著升高趋势，由于微管蛋白基因是柞蚕微孢子虫的持家基因，表达量较稳定，其显著升高，说明在添食后2～4 d时间内，柞蚕体内微孢子虫的数量有增加趋势；而孢壁蛋白基因NpSWP8显著升高，NpSWP35、NpSWP1极显著升高，且比微管蛋白基因的增加趋势更加明显，从这个结果可以看出该时间段伴随着侵入数量的增加，柞蚕微孢子虫侵染作用也增强，可能还存在多次侵染。然后到6 d时表达情况不一，α和γ-微管蛋白基因，孢壁蛋白NpSWP8、NpSWP35基因有持续增长，但增长幅度较4 d时降低，这符合侵染的一般规律，说明柞蚕微孢子虫的侵染数量和效率先增加后趋于平缓；而β-微管蛋白基因、孢壁蛋白NpSWP1基因的表达量反而下降，在展示侵染过程中不合常规，这可能与这2个基因还参与其他生化反应有关，因此在研究柞蚕微孢子虫侵染过程中不适合作为指示基因。

图4 4龄柞蚕感染柞蚕微孢子虫后不同发育时期侵染相关基因的Sq RT-PCR的表达量

图5显示，β-微管蛋白基因在添食后4 d与6 d表达量与2 d相比有极显著的升高，α-微管蛋白基因与孢壁蛋白NpSWP35基因在添食后4 d呈现显著升高，孢壁蛋白NpSWP8基因在4 d时有所升高，β-微管蛋白基因也随着时间的延长有一定的增加趋势，而γ-微管蛋白基因和孢壁蛋白NpSWP1基因的变化情况不明显。但是总体上定量PCR结果不是很理想，这与定量引物设计有关，今后还将对其他柞蚕微孢子虫的孢壁蛋白进行特异性引物的设计，寻找适合进行RT-qPCR分析的孢壁蛋白基因。

图5 4龄柞蚕感染柞蚕微孢子虫后不同发育时期侵染相关基因的RT-qPCR表达量

综合Sq RT-PCR和RT-qPCR的结果，几种目的基因在柞蚕微孢子虫侵染后4 d都有较高的表达量差异变化，可以将添食后4 d作为侵染相关基因检测的初始时间，而α-微管蛋白基因较其他2种微管蛋白基因更适合作为持家基因进行侵染相关过程的研究，孢壁蛋白NpSWP35基因较其他2种孢壁蛋白基因在侵染相关基因的转录水平上更灵敏。

3 小结与讨论

以前人相关基因的研究为基础，本试验克隆得到柞蚕微孢子虫侵染相关的6个基因，α-微管蛋白基因、β-微管蛋白基因、γ-微管蛋白基因和孢壁蛋白NpSWP8、孢壁蛋白NpSWP35以及孢壁蛋白NpSWP1基因，并运用半定量PCR和荧光定量PCR的方法，在柞蚕4龄起蚕添食后的2 d、4 d、6 d这3个初期阶段，进行了柞蚕微孢子虫侵染相关的6个基因的表达差异分析。在进行结果分析时，试验中采用的是柞蚕体内的ApA基因作为内参基因进行对比，3种微管蛋白基因的相对表达量会有较大变化，没有传统意义上持家基因表达量较稳定的情况，是由于本试验将其作为目的基因进行分析，正是利用其在柞蚕微孢子虫中稳定表达的特性来体现柞蚕微孢子虫侵入柞蚕体内的数量情况，并且在后续侵染机理研究中还将作为阳性对照进行相关试验。

孢壁蛋白已经被证实与柞蚕微孢子虫的侵染相关，本试验半定量PCR结果中，也发现孢壁蛋白基因的表达变化比微管蛋白基因要灵敏，这应该与侵染初期的检测时间有关。与柞蚕微孢子虫侵染相关的蛋白或基因，除了本试验选用的孢壁蛋白基因之外，还有微孢子虫的极管蛋白，有研究证明极管蛋白在宿主细胞粘附及侵染的最后阶段发挥作用[14]，但是还未在柞蚕微孢子虫中分离和克隆到，今后将进行相关基因或蛋白的寻找，再将极管蛋白基因与孢壁蛋白基因进行对比，寻找更灵敏的柞蚕微孢子虫侵染相关基因。