5种瑞香科植提取物对7种植物病原真菌的抑菌活性测定

陈云坤，胡春艳，张知宇，赵艳芳，曹 挥

（山西农业大学植物保护学院，山西晋中 030801）

0 引言

植物生长过程中产生的次生代谢产物常含可抑菌、杀虫等活性成分[1]，而植物源农药正是利用植物某些部位的提取物所制成的农药，其原药大多为天然活性成分[2-4]。在当前可持续发展的战略背景下，推进化学农药减量化以及推广植物源农药的使用[5]，是贯彻由高毒到绿色、从高风险到生态安全的绿色发展理念的重要组成部分。

瑞香科是被子植物门双子叶植物纲蔷薇亚纲桃金娘目的一科，在热带和亚热带均有广泛分布[6]，在国内共有10属，分别为瑞香属(Daphne)、荛花属(Wikstroemia)、沉香属(Aquilaria)、结香属(Edgeworthia)、鼠皮树属(Rhamnoneuron)、毛管花属(Eriosolena)、狼毒属 (Stellera)、假 狼 毒 属 (Stelleropsis)、欧 瑞 香 属(Thymelaea)和草瑞香属(Diarthron)，主要分布于长江流域以南，大多数种类的韧皮纤维较发达，瑞香科的10属中瑞香属与荛花属种类最多，在中国分别分布有52种和49种[7-8]。同科植物中主要成分类似主要是由于水分、光照、温度等生长环境会对植物的形态结构以及生理代谢造成影响[9]，在瑞香科植物中瑞香属、狼毒属、荛花属和结香属研究较多，4属植物中主要成分为香豆素、黄酮、萜类等化合物，且多数化合物具有显著的生理活性[10]。

瑞香狼毒为瑞香科狼毒属植物，在国内已广泛用于农业病虫害的防治，试验室前期研究表明，瑞香狼毒提取物对西瓜枯萎病原真菌以及山楂叶螨等病虫害均有良好的生物活性，其主要成分狼毒素A对TMV的增殖扩散也有明显的抑制作用。笔者在瑞香科研究较多的4属植物中，选取瑞香狼毒（狼毒属）、南岭荛花（荛花属）、祖师麻（瑞香属植物黄瑞香的根皮及茎皮）、芫花（瑞香属）以及梦花（结香属植物结香的花）5种植物作为代表，研究其乙醇提取物抑制病原真菌的作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料及仪器

1.1.1 仪器与试剂 气引式粉碎机（佑崎有限公司）、旋转蒸发仪IKA（上海亚荣生化仪器厂）、超净工作台（苏州净化设备有限公司）、恒温培养箱（上海皓庄仪器有限公司）、电子天平（龙腾电子有限公司）、高压灭菌锅（西安仪创仪器设备有限公司）、葡萄糖（天津市北辰方正试剂厂）、琼脂粉（北京索莱宝科技有限公司）。

1.1.2 供试菌株及植株 茄子枯萎(Fusarium oxysporumf.sp.)、黄瓜枯萎(Fusarium oxysporumsp.)、黄瓜炭疽(Colletotrichum orbiculare)、黄 瓜 靶 斑 (Corynesporacassiicola)、草莓红中柱(Phytophthora fragariae)、番茄枯萎(Fusarium oxysporumf.sp.)、辣椒枯萎(Fusarium oxysporumf.sp.)所有菌种均由山西农业大学植物病理试验室分离鉴定并提供，供试植株名称及部位见表1。

表1 供试植株名称及部位

1.2 试验方法

1.2.1 植物提取物的制备方法 将各种植物材料磨碎成粉末状，各称量800 g，将其以每瓶200 g分装在广口瓶中与乙醇1:2混合放置72 h初步浸提，后在30℃的条件下进行30 min的超声波浸提，将混合物放入真空抽滤装置进行分离，收集到的液体即为植物的初提物，将粉末状物质进行回收分装后再次与乙醇混合，重复以上步骤4次，混合提取液进行浓缩，并测定浓缩后提取液的提取率及浓度（表2）。

表2 供试植物提取物提取率以及提取物浓度

1.2.2 5种植物提取物的抑菌活性测定 在超净工作台中利用涡旋震荡仪将各个提取物制作成8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mg/mL的含药PDA平板，以加入等体积乙醇的平板作为空白对照，每种处理重复5次。将已活化的病原真菌的菌落边缘打孔(0.7 cm)，挑取至平板后，放入27℃培养箱中进行培养。利用十字交叉法测量不同培养时间的菌落直径，当空白对照的菌落长到平板直径的3/4处时进行最后一次测量，并将各处理的菌落状态拍照备用，利用DPS软件完成毒力分析。

2 结果与分析

2.1 5种瑞香科植物提取物对7种病原真菌的抑制效果

5种瑞香科植物8 mg/mL提取物对7种病原真菌的抑制效果见表3。瑞香狼毒和梦花2种提取物生物活性较强，对所有病原菌的抑制效果在8 mg/mL下达到100%。所有瑞香科植物提取物在8 mg/mL时对番茄枯萎和黄瓜炭疽的抑制率都达到了100%，南岭荛花提取物对其余5种病原真菌的抑制率没有达到100%，但大部分接近90%。综合来看，瑞香科提取物对黄瓜靶斑的抑制率低，均为所有病原真菌中最差，但都不低于65%。

表3 5种瑞香科8 mg/mL提取物对7种病原菌丝生长的抑菌效果

如图1，茄子枯萎菌在96 h时CK长到约平板的3/4处，此时梦花与瑞香狼毒提取物在8 mg/mL对菌落的抑制率为100%，祖师麻、芫花提取物在高浓度下抑制率较差，均小于90%。随着浓度的降低各提取物对菌落的抑制效果也每况愈下，但在中浓度2 mg/mL时梦花提取物的表现最佳，其抑制率仍在80%以上。低浓度0.5 mg/mL时芫花和瑞香狼毒的表现较好，抑制率均高于20%。

图1 不同浓度瑞香科植物提取物对茄子枯萎的菌落抑制效果

如图2，茄子枯萎菌在120 h时CK长到约平板的3/4处，此时在高浓度8、4 mg/mL下，梦花与瑞香狼毒提取物的表现最好，抑制率均达到了100%，在中浓度2 mg/mL时2种提取物也保持着较好的抑制效果，但梦花提取物的抑菌表现略好于瑞香狼毒提取物。低浓度时梦花提取物的表现逐渐变差，但瑞香狼毒的抑制率在所有提取物中表现最佳，在0.5 mg/mL时抑制率仍接近30%。

图2 不同浓度瑞香科植物提取物对黄瓜枯萎的菌落抑制效果

黄瓜炭疽病原菌在96 h时CK长到约平板的3/4处，此时在高浓度8 mg/mL时，所有提取物的抑菌效果均为100%，由图3可知，随着提取物浓度的降低，瑞香狼毒提取物的抑制率保持着较高的水平。其余4种提取物的表现较为均衡，都有着不错的抑菌效果，尤其是梦花提取物在4 mg/mL时的抑菌率仍为100%。

图3 不同浓度瑞香科植物提取物对黄瓜炭疽的菌落抑制效果

如图4，黄瓜靶斑病原菌在120 h时CK长到约平板的3/4处，在高浓度8 mg/mL下瑞香狼毒与梦花提取物的抑制率均为100%，但随着浓度的降低，梦花提取物的抑制效果大幅减弱。芫花与祖师麻提取物在高浓度时表现不太理想，但是浓度的降低并未对其抑菌率产生大幅影响，在最低浓度时2种提取物的抑菌率仍大于30%。所有提取物中，南岭荛花的表现较差，在低浓度时基本没有抑菌效果。

图4 不同浓度瑞香科植物提取物对黄瓜靶斑的菌落抑制效果

草莓红中柱病原菌在120 h时CK长到约平板的3/4处，由图5可明显看出南岭荛花提取物的抑菌效果不佳，在高浓度4 mg/mL下的抑制率仅为30%。最低浓度时瑞香狼毒和祖师麻提取物的抑菌率较高，均高于20%，梦花提取物虽然在低浓度时表现不理想但在高浓度时的抑菌效果较好，仅次于瑞香狼毒提取物。

图5 不同浓度瑞香科植物提取物对草莓红中柱的菌落抑制效果

由图6可知，辣椒枯萎病菌在120 h时CK长到约平板的3/4处，除南岭荛花外其余提取物在8 mg/mL时的抑制率均为100%，中浓度1 mg/mL时，梦花、祖师麻提取物的抑菌效果迅速变差，但瑞香狼毒提取物的抑菌率仍在较高水平，当浓度降低至0.5 mg/mL时，仅瑞香狼毒提取物的抑菌率达到30%以上。

图6 不同浓度瑞香科植物提取物对辣椒枯萎的菌落抑制效果

由图7可知，番茄枯萎在96 h时CK长到约平板的3/4处，在高浓度时梦花与瑞香狼毒提取物的表现最佳，随着浓度的降低瑞香狼毒提取物仍有着较好的表现，而梦花提取物的抑制效果出现断崖式下跌，芫花提取物在低浓度0.5、0.25 mg/mL时的抑制效果仅次于瑞香狼毒。

图7 不同浓度瑞香科植物提取物对番茄枯萎的菌落抑制效果

2.2 5种瑞香科植物提取物对7种病原真菌的毒力测定

由表4～8综合来看，在对茄子枯萎菌、黄瓜炭疽和番茄枯萎的毒力测定中，瑞香狼毒与梦花在所有提取物中效果最好，EC50值均小于0.81 mg/mL，祖师麻提取物对黄瓜靶斑与草莓红中柱的抑制率在所有提取物中最强，EC50值为0.92 mg/mL左右，梦花对草莓红中柱的抑制活性次之，其EC50值为0.983 mg/mL。芫花提取物对黄瓜靶斑的抑制作用仅次于祖师麻，但对茄子枯萎与黄瓜枯萎的抑制效果在所有提取物中最弱，EC50值分别为1.141、2.259 mg/mL。对于黄瓜枯萎和辣椒枯萎来说，抑制作用最强的分别是梦花与瑞香狼毒的提取物，EC50值为0.754、0.736 mg/mL。南岭荛花相对于其他提取物来说表现不佳，对黄瓜靶斑、草莓红中柱、番茄枯萎、辣椒枯萎4种菌的抑制活性均为所有提取物中最弱，EC50值分别为2.182、2.710、1.065、1.950 mg/mL。

表4 瑞香狼毒提取物对7种病原真菌的毒力测定

表5 南岭荛花提取物对7种病原真菌的毒力测定

表6 祖师麻提取物对7种病原真菌的毒力测定

3 结论与讨论

中国有着十分悠久的中药文化，在人们对绿色食品日益增长的需求中以及国家政策等力量的推动下，利用植物中活性成分制成的植物源农药，已成为当今热门的研究[11]。

本试验所选取的瑞香科植物为落叶或常绿灌木或小乔木，其中许多植物均有药用价值。在中药中，瑞香狼毒、狼毒大戟或月腺大戟的干燥根均可作为狼毒入药，具有止痛、抗病毒、抗癫痫等多种功效[12]，对大肠杆菌、同心性毛癣菌等人源细菌、真菌也有良好的抑制效果[13]。且瑞香狼毒提取物对番茄晚疫病菌、玉米大斑病菌、辣椒疫霉菌[14]、小麦赤霉病菌和黄瓜枯萎菌[15]等多种植物病原真菌有良好的生物活性，研究表明黄酮和香豆素类化合物为其主要的抑菌活性物质[16]。本试验中，瑞香狼毒在5种瑞香科植物提取物中表现良好，在8、4 mg/mL时的抑制效果大多都达到了100%，对茄子枯萎、番茄枯萎和辣椒枯萎3种枯萎菌的抑制中浓度均小于0.90 mg/mL。

表7 芫花提取物对7种病原真菌的毒力测定

表8 梦花提取物对7种病原真菌的毒力测定

南岭荛花又名了哥王，耐干旱，生于山坡的路旁或荒草地中[17]，黄酮类、香豆素类等为其主要次生代谢成分[18]。有学者研究表明，了哥王乙酸乙酯提取部位具有广谱的抑制细菌活性[19]，且具有较好的镇痛抗炎效果[20]。此外，了哥王中分离的许多活性成分（如西瑞香素、芫花素等）具有明显的抗肿瘤活性，对消炎、抗病毒以及改善心肌血流量等也有良好的功效[21]。查阅资料发现，南岭荛花对真菌，尤其是对病原真菌的抑制效果及机理方面的研究较少，本试验发现南岭荛花在5种瑞香科植物提取物中表现最差，但对番茄枯萎和黄瓜炭疽的抑制效果良好，在高浓度下抑制率达到了100%，且EC50值均小于1.10 mg/mL，具有一定的研究价值。

祖师麻主要由瑞香科植物黄瑞香、陕甘瑞香及凹叶瑞香的根皮及茎皮组成，长白瑞香及结香均可作中药祖师麻入药[22]，主要成分为香豆素类、黄酮类、木脂素类等化合物[23]，在民间被广泛用于治疗跌打损伤、风湿和支气管炎等症状[24]，也具有较好的抗炎、镇痛以及抗肿瘤活性[25-26]。有研究表明，黄瑞香的水提物对小麦条锈病菌的抑制作用良好[27]，其乙醇提取物对小麦纹枯病菌和小麦赤霉菌有显著的抑制效果，且具有良好的热稳定性[28]。本试验中祖师麻的抑菌效果良好，尤其是对黄瓜靶斑和草莓红中柱2种病原菌的抑制作用尤为显著，EC50值均小于0.93 mg/mL，但对枯萎菌的生物活性在5种瑞香科植物提取物中没有明显的优势。

芫花在国内分布广泛，常用作中药，有治疗痰饮积聚、气逆喘咳之效，其化学成分结构多变，具有极大的研究意义[29]。现代药理试验显示芫花具有抗肿瘤、抗炎等多种活性[30-31]。Tadataka等[32]从芫花中分离出4种黄酮类化合物，其中木犀草素和芹菜素2种化合物具有很强的抗氧化活性。贾俐莉[33]通过流式细胞技术发现，了哥王、芫花和黄芫花的醇提物均对HIV-1潜伏感染有再激活作用。研究表明芫花的乙醇提取物对小麦全蚀病菌、辣椒疫霉病菌和番茄灰霉病表现出较好的持续抑菌效果[34]。本试验中芫花对4种枯萎病的抑制活性较差，但对其余3种病原菌的抑制中浓度均小于1.1 mg/mL。

结香与其他树种相比，易种植且有很强的抗病虫害能力，目前尚未发现被病虫危害现象[35]。据目前国内外文献报道，从结香的根茎及花中分离的化合物主要包括有机酸、黄酮类、香豆素类及香气化合物等[36]。结香花蕾与中药材密蒙花的性状以及药用价值较为相似，所以常被作为密蒙花的替代品。韩佳[37-38]通过乙醇浸泡回流，后经石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取后，发现各萃取物对大肠杆菌、金色葡萄球菌、产气杆菌、枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌均有不同程度的抑制作用，且结香花的提取物具一定的抗氧化活性，与其总黄酮含量呈显著的浓度依赖性。近年来，随着人们对结香化学成分的提取、分离与结构鉴定，以及对其提取物的药理药效试验研究的深入，结香在医药、食品、化妆品等领域已经取得了一定的进展[39]，但与南岭荛花、祖师麻、芫花类似，在抑制病害真菌方面的研究较少。本试验中，梦花提取物对茄子枯萎、黄瓜枯萎、番茄枯萎的抑制效果最佳，且在较高的浓度下对7种病原菌的抑制作用都接近100%。综上所述，梦花与瑞香狼毒在供试的5种植物材料中抑菌效果最佳，尤其是在抗枯萎病方面，梦花有着极高的研究价值。

本试验采用菌丝生长速率法研究了瑞香狼毒、南岭荛花、祖师麻、芫花以及梦花5种瑞香科植物提取物对7种病原真菌的抑菌活性，旨在寻找出一类有潜力的植物资源用以防治植物病害。结果表明5种瑞香科提取物针对不同病原真菌普遍都有较好的抑菌活性，其中梦花与瑞香狼毒的提取物在针对各种枯萎菌的抑制中，有着突出的表现。虽然南岭荛花在所有供试提取物中表现最差，但除了抑制黄瓜靶斑、草莓红中柱两种病原菌的效果欠佳，对其余5种病原真菌的抑制中浓度均小于2 mg/mL。瑞香科植株生境相似，其次生代谢活性成分也普遍为黄酮类、香豆素类等，甚至有些同科植物在中药学中可以同等入药，结合本试验结果表明，瑞香科植物有成为防治植物病原真菌的新型植物源农药的潜力。