国产与进口DMEM培养ST细胞及应用效果比较

何锡忠　李嘉皓　林鸷　赵本进　朱永军　彭丽英

摘  要：为比较国产与进口达尔伯克改良伊格尔培养基（dulbecco's modified eagle's medium，DMEM）培养猪睾丸（swine testis，ST）贴壁细胞和培养猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）、猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）和猪传染性胃肠炎病毒 （transmissible gastroenteritis virus，TGEV）的效果，本试验采用国产与进口DMEM培养同批ST细胞，连续传代10代，并分别接种培养PPV、PRV和TGEV。结果显示，用国产DMEM培养ST细胞72 h后，连续10代细胞的密度均达到1.25×10⁶个/mL以上，细胞增殖达5倍以上，与进口DMEM培养结果相似，两者无显著差异（P>0.05）;两种培养基培养同一病毒的滴度相近，两者无显著差异（P>0.05）。试验表明，国产DMEM能达到进口培养基的培养水平，为国产DMEM替代进口DMEM来大规模培养PRV、PPV和TGEV等提供了科学依据。

关键词：ST细胞;国产与进口DMEM;培养

中图分类号：S852 文献标志码：C 文章编号：1001-0769（2022）04-0030-04

病毒是专性寄生物，自身无完整的酶系统，不能进行独立的物质代谢，必须在活的宿主细胞内才能进行生长、复制和增殖。自20世纪40年代末首次发现脊髓灰质炎病毒在体外非神经组织上生长复制以来，细胞培养已成为培养病毒的主要方法[1]。培养基是维持宿主细胞生存和生长所需的基本溶液，国产与进口都属于合成达尔伯克改良伊格尔培养基（dulbecco's modified eagle's medium，DMEM），是按人和动物体内细胞所需成分模拟合成、配方恒定的一种较理想的培养基。合成培养基的出现促进了组织培养的发展，减少了生物个体差异的影响[2]。目前培养猪睾丸（swine testis，ST）细胞的DMEM主要依赖进口，价格昂贵，而且受限因素很多。近几年，国产DMEM发展迅速。本研究对国产和进口DMEM培养ST细胞的效果进行比较，并对猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）、猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）和猪传染性胃肠炎病毒 （transmissible gastroenteritis virus，TGEV）在国产和进口培养基培养的ST细胞中敏感性进行分析，以期为国产DMEM大规模培养病毒等提供科学依据。

1  试验材料

1.1 细胞和病毒毒株

ST细胞株购自湖南丰晖生物科技有限公司。PRVsx-gE、PPV和TGEV毒株由上海市农业科学院动物疾病诊断检测中心保存。

1.2 试剂及耗材

进口DMEM、新生牛血清、胰酶购自GIBCO公司，国产DMEM由上海源培生物科技股份有限公司提供。

1.3 主要仪器

CO₂培养箱购自Thermo公司;Retiga 2000R高敏感度冷荧光数码显微镜购自日本奥林巴斯公司。

2  试验方法

2.1 ST贴壁细胞培养

取形成致密单层的适量T-75方瓶ST细 胞，用含0.2%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的PBS清洗3次，加入 0.25%胰酶消化片刻，倾去胰酶，分别用含10%新生牛血清的国产与进口DMEM制备成细胞悬液，将细胞初始接种密度统一为0.25×10⁶个/mL，每组重复做4瓶，37 ℃培养72 h。

2.2 ST贴壁细胞连续传代

细胞培养成致密单层后，按照“2.1 ST贴壁细胞培养”中的方法消化ST贴壁细胞，分别用含10%新生牛血清的国产与进口DMEM制备成细胞悬液，将细胞初始接种密度调整为0.25×10⁶个/mL，每组重复做3瓶，取其平均数，37 ℃培养72 h后传代，连续传10代。观察不同DMEM对细胞连续传代的影响。

2.3 病毒培养试验

分别取国产与进口DMEM培养的致密单层的适量T-75方瓶ST细胞，按照“2.1 ST贴壁细胞培养”中的方法消化ST贴壁细胞，分别用含10%新生牛血清的国产与进口DMEM制备成细胞悬液，按1∶4接种传代，37 ℃培养48 h，弃培养基后加入适量PBS洗涤3次，分别接种培养PPV、PRV和TGEV，具體操作如下：

2.3.1 ST细胞接种PPV

取洗涤好的ST细胞各3瓶，每瓶按1%接种PPV工作种毒，37 ℃恒温箱内吸附1.5 h，向瓶内分别加入国产或者进口DMEM的细胞维持液（含1%～2%的犊牛血清）至10 mL，使维持液中毒种含量为0.1%，37 ℃恒温箱培养96 h。观察到50%以上的细胞出现明显病变时收获，反复冻融3次后测定滴度。

2.3.2 ST细胞接种PRV

取洗涤好的ST细胞各3瓶，每瓶按1%接种PRV工作种毒，37 ℃恒温箱内吸附1 h，向瓶内分别加入国产或者进口DMEM的细胞维持液（含1%～2%的犊牛血清）至10 mL，使维持液中毒种含量为0.1%，37 ℃恒温箱培养48 h。观察到70%以上细胞出现拉丝变长、拉网脱落现象时收获，反复冻融3次后测定滴度。

2.3.3 ST细胞接种TGEV

操作同上，观察到70%以上细胞呈颗粒状、拉网脱落现象，液相的透明度浑浊（但不是污染的云烟状）时收获，反复冻融3次后测定滴度。

2.4 细胞密度和TCID50测定

用含0.2% EDTA的PBS清洗3次，加入0.25%胰酶消化片刻，倾去胰酶，用DMEM制备成细胞悬液，取样后用含10 g/L结晶紫的柠檬酸溶液染色，用血细胞计数板计数细胞。TCID50测定按照常规方法测定。

3  结果与分析

3.1 ST贴壁细胞培养情况

由表1可知，用国产与进口DMEM培养ST细胞，72 h后细胞均增殖到1.25×10⁶个/mL以上，增加了5倍多，两者无显著差异（P>0.05），表明国产DMEM适合用于ST贴壁细胞培养。

3.2 ST细胞连续传代情况

结果（表2）显示，用国产DMEM静止培养72 h，第1代～第10代细胞密度均达到1.25×10⁶个/mL以上，与进口DMEM相似，两者无显著差异（P>0.05），表  明国产DMEM也可以连续传代培养ST细胞。

3.3 PPV、PRV和TGEV在ST细胞中的增殖

如表3所示，两种培养基培养同一病毒的滴度相近，两者无显著差异（P>0.05），初步表明PPV、PRV和TGEV在用国产DMEM培养的ST细胞中能正常增殖。

4  結论与讨论

为了评价国产DMEM的质量，以进口DMEM为对照，比较两种培养基培养ST细胞的生长状态和几种病毒在ST细胞中增殖的一致性。本试验结果表明，国产DMEM培养ST细胞的生长状态与进口DMEM相似，用国产DMEM培养ST细胞来增殖PPV、PRV和TGEV，均能到达毒价标准。

李建平等[3]比较了国产与进口DMEM培养CHO-C28细胞的培养上清中HBsAg表达水平，发现国产培养基略好于进口培养基，二者纯化图谱和抗原电泳图谱一致。

用原来过滤系统除菌过滤培养基，进口培养基通透性优于国产，可能是添加的营养成分不同所致;更换过滤系统后二者通透性基本一致。

综上所述，通过利用国产DMEM培养ST细胞及应用于PRV、PPV和TGEV的增殖培养，国产DMEM达到了进口培养基水平，可用于规模化生产。

参考文献

[1] 张振兴，姜平.实用兽医生物制品技术[M].北京：中国农业科技出版社，1996.

[2] 张元兴，易小萍，张立，等.动物细胞培养工程     [M].北京：化学工业出版社，2007.

[3] 李建平，周长，军王宇，等.国产与进口DMEM培养基培养CHO-C28细胞效果比较[J].中国生物制品学杂志，2007，20（3）：219-222.