茭白内生真菌的分离与鉴定

陈虹　丁晨曦

摘 要 以表面消毒法和组织培养法从正常茭白和灰茭中分离出6株内生真菌，对纯化后的内生真菌进行形态学鉴定和真菌ITS序列分析鉴定。结果：从正常茭白组织内分离到5株真菌，经鉴定分别为红酵母属（Rhodotorula sp.）、镰刀菌属（Fusarium sp.）、链格孢属（Alternaria sp.）、酵母科（Saccharomycetaceae）、毕赤酵母属（Pichia sp.）真菌，其中J-4菌株与最相似菌株的序列比对相似度自检支持率仅为84%，因此无法确定到具体的属名，仅能确定为酵母科微生物;从灰茭中分离到菰黑粉菌（Ustilago esculenta sp.）。实验表明茭白植株内除了菰黑粉菌之外，还有其他种类的内生真菌存在。

关键词 茭白;内生真菌;分离;鉴定;菰黑粉菌

中图分类号：S645.2 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.17.042

菰[Zizania latifolia（Griseb.）Stapf]别称茭白、茭瓜、茭笋、高瓜等，是一种在我国有着3 000多年种植历史的禾本科水生植物。古人采集菰的种子即菰米食用，早在我国周朝时期菰就被记为六谷之一[1]。在后来的种植过程中，菰植株被菰黑粉菌（Ustilago esculenta P. Henn）侵染后，抽穗开花受到抑制，茎部组织膨大成肉质茎，即为鲜嫩可食用的茭白，后来成为主要的蔬菜经济作物。

菰黑粉菌是一种典型的植物内生真菌，会刺激菰植株内细胞的异常生长，使菰成为一种特殊的蔬菜。茭白作为我国第二大水生蔬菜，已有许多相关研究报道，其中菰黑粉菌在孕茭过程中的作用已被研究得较为透彻。由于菰黑粉菌的影响，茭白有3种表现型，即正常茭、灰茭及雄茭。菰植株被菰黑粉菌侵染并成功繁殖后，其茎部膨大形成可食用的正常茭，且菰黑粉菌与茭白植株多年同生，即菰黑粉菌以菌丝型（MT型）存在;若黑粉菌潜伏周期缩短，则在茭白膨大初期，内部形成黑褐色冬孢子（T型），使得茭白洁白的肉质茎中布满黑色斑点，这样的茭白则称为灰茭，一般不能食用;如果菰植株成功抵抗住了菰黑粉菌的侵入，能够继续开花结实，但不会长出茭白的植株称为雄茭[2-3]。

植物內生真菌在多数情况下并不影响植物的正常生长发育，不会表现出病害症状。内生真菌普遍存在于植物组织内，种类较多，根据内生真菌与宿主专一性分析，平均每种植物中约有4～5种内生真菌[4]，基于全球庞大的植物种类，可见植物内生真菌的总数量巨大。目前，内生真菌与宿主植物之间的共生机制、内生真菌天然代谢产物、对植物生长和抗病虫害作用机制等都是研究热点。关于茭白内生真菌的研究，一直以来对菰黑粉菌的关注较多[5]，除占梦丹从茭白植株中分离到毛霉菌和烟管菌外[6]，少有茭白中其他内生真菌的报道。本研究对正常茭白和灰茭中的内生真菌进行分离和鉴定，为茭白内生真菌的多样性研究、内生真菌的开发利用提供参考依据。

1  材料与方法

1.1  材料与仪器

1.1.1  植物材料

2021年12月初采自宁波市海曙区洞桥镇百樑村水田的正常茭白2 kg和灰茭0.5 kg。

1.1.2  主要试剂

次氯酸钠、无水乙醇、葡萄糖为市售分析纯试剂，氨苄青霉素、UNIQ-10柱式真菌基因组抽提试剂盒、真菌通用引物ITS1和ITS4、PCR扩增试剂盒（Taq）均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3  仪器与设备

光学显微镜[尼康仪器（上海）有限公司，YS 100]、PCR仪（美国BIORAD公司，MJ-PTC-200）、凝胶电泳仪（杭州博日科技股份有限公司，GE-100）、高压灭菌锅（日本Hirayama公司，HVA-110）、摇床（上海苏坤实业有限公司，SKY-2102C）。

1.2  方法

1.2.1  真菌的分离培养

先将茭白样品用实验室流水清洗干净，再使用无菌水冲洗3遍，次氯酸钠消毒8 min，无菌水冲洗3遍，75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3遍。用灭菌过的解剖刀切去茭白表皮，然后将中间部分组织切片，切取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的组织切片，置于含氨苄青霉素的PDA固体培养基上，28 ℃培养3～7 d。取最后一次冲洗茭白的无菌水涂布于PDA平板上培养作为对照。定期观察茭白样品组织切片周围是否有菌丝长出，及时转接。采用菌丝顶端纯化法对分离到的真菌进行2～3次分离纯化。

1.2.2  真菌的鉴定

形态学鉴定：纯化后的丝状真菌采用插片法观察菌丝及孢子形态，单细胞真菌直接挑取少量菌落用生理盐水稀释后盖上盖玻片镜检，并结合各个菌株的菌落形态，对照《真菌分类学》[7]进行形态鉴定。

内生菌株的ITS分子鉴定：将纯化的菌种接种至PDA液体培养基培养6 d，通过抽滤、离心的方法获得菌体。采用上海生工的UNIQ-10柱式真菌基因组抽提试剂盒制备各菌株的基因组DNA。选择通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），进行PCR扩增。PCR反应体系为50 μL（2×Taq Mix 25 μL，DNA模板、ITS1、ITS4各1 μL，ddH2O 22 μL）。PCR扩增条件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，30个循环;72 ℃ 10 min。之后取10 μL反应液用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行序列相似性比对分析，利用MEGA7.0软件的NJ法对扩增片段序列和部分已知的真菌DNA序列做进化树分析。

2  结果与分析

2.1  正常茭白与灰茭的观察

将正常茭白及灰茭对半切开后可见两者内部的不同（见图1），正常茭白组织白色细腻，灰茭内部则分布着一个个黑色的冬孢子堆，取冬孢子堆粉末进行稀释镜检，可以看到褐色圆形的黑粉菌冬孢子。

2.2  真菌分离纯化及形态鉴定结果

将正常茭白及灰茭经外部消毒后，组织切块接种于PDA平板，48 h后隐约可见组织块边上有菌落及菌丝长出，至72 h左右菌落菌丝明显可见，此时取菌丝尖端进行分离，并多次在平板上划线分离纯化，最终筛选得到6种形态的真菌。菌落及镜检照片如图2所示，结合菌落形态学特征及典型的菌丝特征，查询《真菌分类学》后作出初步鉴定。

J-1～J-5分离自正常茭白的组织，其中包括3种酵母及2种丝状真菌。J-1的菌落为红色酵母样，在最初被认为是环境污染所致，但是数次重复分离实验中均发现此菌出现在正常茭白周边，且作为对照的空白平板未有真菌污染，所以判断此菌源自于正常茭白组织内。J-2菌落洁白蓬松，经过平板插片法观察到镰刀形的分隔孢子，为典型的镰刀菌属真菌。J-3与J-2菌一开始混合生长，经过多次分离后纯化出来。J-3菌落呈絮状，初期白色，老后变暗;背面呈褐色，插片法观察到典型的棒状具有纵横隔膜的分生孢子，可确定为链格孢属真菌。J-4、J-5的菌落为乳白色酵母状，J-4的菌落光滑且边缘整齐，J-5的菌落表面有些干燥。经过镜检观察，J-4具有酵母菌椭圆形单细胞且出芽生殖的典型特征，J-5菌株则是多个椭圆形出芽细胞连起来呈假菌丝状。J-6菌是源自于灰茭内部的黑粉菌孢子。对于灰茭内生真菌的分离，本实验采取了组织切片放置培养及冬孢子稀释涂布培养，组织切片样本周边生长的菌落形态单一，且与冬孢子涂布后长出来的菌落形态一致，菌落乳白色，外观类似酵母菌落，但该菌落表面粗糙、较干燥，边缘规则。用接种环挑取少许菌落进行稀释镜检，看到细长针状具分隔的细胞，继续培养可产生分枝，这与李志兰等在菰黑粉菌孢子萌发过程形态学观察到的情况一致[8]。

2.3  茭白内生真菌的5.8S rDNA-ITS序列分析

将6株内生真菌提取基因组，进行ITS序列PCR扩增后的产物交由上海生工进行测序后，所得到的结果放在NCBI上进行Blast比对，除J-4菌株与最为相似的Pichia cactophila菌株的序列比对相似度为94.82%外，其余菌株与各自对比菌株的最高相似度均高于96%。将所得菌株的测序序列及Blast网站上比对结果最相似的序列通过MEGA 7.0软件，采用临近法构建系统发育树（见图3）。J-2、J-3、J-6菌株与各自最相似菌株的自检支持率为100%，J-1、J-5菌株與其最相似菌株的自检支持率均为99%，结合之前各个菌株的菌落特征及镜检到的菌丝、孢子形态特征，可以确定各自的归属（见表1）。J-4菌株与最相似菌株的序列比对相似度自检支持率仅为84%，因此无法确定到具体的属名，只知是酵母科（Saccharomycetaceae）微生物。

3  小结与讨论

本研究对正常茭白和灰茭的内生真菌进行分离和鉴定，得到镰刀菌属和链格孢属真菌各1株，酵母菌3株，菰黑粉菌1株。与此前占梦丹在茭白中分离到的烟管菌、毛霉菌不同，这5种真菌均为首次检出。在灰茭中仅分离到菰黑粉菌，未分离到别的菌株;在正常茭白中分离到其他5种真菌。由于本实验取样时间在冬季，气候寒冷，植株和微生物处于休眠期，若在生长旺盛的季节，有可能会分离到更多种类的内生真菌。冬季灰茭内部已经形成大量的黑粉菌冬孢子堆，其菌丝充满茭白组织内，具有明显生长优势，其他内生真菌的含量极少。曹乾超等用切片和研磨法从正常茭白中分离出菰黑粉菌，认为采用茭白组织研磨法比切片培养法更容易分离到菰黑粉菌[9]。

内生真菌在植物中广泛存在，从每种植物中都能分离到不同种类的内生真菌。孙璐等在毛序棘豆中分离到10属29株内生真菌，其中链格孢属和镰刀菌属是优势菌属[10];魏艳妮等在远志中分离到19属36种内生真菌，不同生长年限、定殖部位的内生真菌在种类和数量上也有差异，且镰刀属和链格孢属也是远志内生真菌中的优势属[11]。陈颐辉等在化感水稻中分离到粘红酵母和镰刀菌[12];裴冬丽等在银杏根中分离到酵母和链格孢属真菌[13]。可以看出，本研究从茭白中分离到的这5种真菌是植物中常见的内生真菌。

内生真菌与植物之间的关系较为复杂，多种内生真菌同时存在于植物内部，起到一定的竞争作用或者互相协调作用。除了菰黑粉菌之外，其余内生真菌在茭白孕茭中能否起到促进作用或是抑制黑粉菌的生长等，还有待于进一步研究。

参考文献：

[1]  李时珍.《本草纲目》谷部第二十三卷.菰米（校点本第三册）[M].北京：人民卫生出版社，1978：1487-1488.

[2]  余永年.茭白黑粉菌刺激生长物质的研究[J].植物学报，1962，10（4）：339-350.

[3]  曹乾超，张雅芬，崔海峰，等.菰黑粉菌的研究进展[J].长江蔬菜，2016（6）：25-29.

[4]  Petfini O. Fungal endophytes of tree leaves[M]. New York： Springer-Verlag， 1991：179-197.

[5]  张治平，耿园，戴海博，等.茭白黑粉菌（Ustilago esculenta）研究进展[J].江苏农业科学，2016，44（12）：45-48.

[6]  占梦丹.茭白两种内生真菌分离纯化及培养条件优化[D].合肥：安徽农业大学，2017.

[7]  邵力平，沈瑞祥，张素轩，等.真菌分类学[M].北京：中国林业出版社，1984.

[8]  李志兰，尤文雨，邹克琴，等.菰黑粉菌孢子萌发过程形态学观察及系统发育研究[J].中国计量学院学报，2010，21（2）：140-145.

[9]  曹乾超，张雅芬，崔海峰，等.菰黑粉菌分离方法的研究[J].长江蔬菜，2015（22）：195-197.

[10] 孙璐，任祯慧，宋润杰，等.毛序棘豆内生真菌分离鉴定及系统进化分析[J].畜牧兽医学报，2018，49（9）：2025-2035.

[11] 魏艳妮，杨冰月，罗露，等.远志内生真菌分离与鉴定研究[J].辽宁中医药大学学报，2021，23（5）：35-40.

[12] 陈颐辉，张宽朝，滕斌，等.化感水稻内生真菌的分离鉴定及其发酵产物的生物学效应研究[J].热带作物学报，2021，42（12）：3598-3604.

[13] 裴冬丽，张红岩，韩汝豪，等.银杏内生真菌的分离纯化及抑菌性的鉴定[J].湖北农业科学，2015，54（9）：2116-2119.

（责任编辑：易  婧）

收稿日期：2022-05-10

基金项目：浙江树人学院教学方法改革项目（2021JS2007）。

作者简介：陈虹（1978—），女，浙江宁波人，硕士，高级实验师，研究方向为应用微生物学。