SymWhite?377，一种源于天然灵感的高效美白成分

01市场背景

从古至今，“一白遮百丑的”观念始终深入人心。即使社会对“美丽女性”的定义会随着文化和时尚的演变而不断调整，但唯独“肤白”的标准始终屹立不倒。根据智研咨询发布的《2017—2022年中国美白市场监测及前景预测报告》，超过80%的女性有美白需求。

另外根据美丽修行大数据显示，2021年美白祛斑市场规模高达5013亿元。因此在美白的道路上，女性尤其是亚洲女性的追求永无止境，并最终为美白活性成分的持续发展增加推动力。

02开发思路

开发一种新型皮肤增白剂的方法有很多。包括：①抑制黑色素生成;②抑制黑色素从黑色素细胞向角质形成细胞转移;③抑制黑素细胞树突生长;④抑制角质形成细胞分泌的促黑色素因子如α-MSH或内皮素-1;⑤促进黑色素代谢[1，2，3]。在这些策略中，通过抑制酪氨酸酶活性来抑制黑色素的产生是最有效的。因为酪氨酸酶催化了黑色素生物合成过程中第一步及速度控制步的反应，即由酪氨酸羟基化生成3，4一二羟基苯丙氨酸（多巴）。

羟基芪化合物已被证明是有效的酪氨酸酶抑制剂。白藜芦醇是一种植物抗毒素，可从毛叶藜芦（根）、西伯利亚红松（树皮）、葡萄等多种植物中提取。而氧化白藜芦醇是从桑叶中提取的一种活性物质也是这类物质的主要代表。白藜芦醇与曲酸具有相同的活性，但其氧化活性是曲酸的32倍[4]。此外，从面包果树中提取的二苯乙烯衍生物，如高黄绿桑和异戊二烯氧化白藜芦醇，其效果分别是曲酸的33.3倍和13.1倍[5]。但众所周知，二苯乙烯极其不稳定，两个苯环之间的反式双键在辐射下容易发生异构反应，形成相应的顺式二苯乙烯。后者快速分解，形成环丁烷二聚体和更多的高分子量光化学产物。

我们的目标是开发一种具有优良美白效果的光稳定二苯乙烯衍生物。我们从樟子松（Pinussylvestris）的亲脂提取物中发现3，5-二羟基二苯乙烯和3-0-甲基衍生物，它们是优良的酪氨酸酶抑制剂，但光照不稳定。因此，我们通过化学合成对赤松的结构进行了改进，以获得最佳的功效和稳定性。最后以二苯基甲烷衍生物4-（1-苯乙基）-1，3-对苯二酚（SymWhite？377）为靶向成分，进行了大量的功效试验。体外和体内实验证明它是一种高效的皮肤增白剂。

03功效验证

3.1材料

蘑菇酪氨酸酶（EC.1.14.18.1），购自FLUKAChemieGmbH（Buchs，Switzerland）;l-3，4-二羟基苯丙氨酸，购自跨有机公司（美国新泽西州）;所有细胞培养液来自cambrex（Verviers，Belgium）;Melanoderm水平el-300-b型，MattekCorporation（Ashland，Ma，USA）;所有其他试剂（分析纯）均购自sigma（Taufkirchen，德国）。

3.2酪氨酸酶分析试验

在含50μg/ml蘑菇酪氨酸酶的66.7mM磷酸盐缓冲液（pH6.8）中进行酪氨酸酶反应，试验化合物（最终浓度为0.1—1000μg/ml）。反应混合物在96孔微孔板上37°C预培养10min。加入L-3，4-二羟基苯丙氨酸0.1mg/ml（终浓度），在474nm处用分光光度计测定所形成的多巴色素。抑制效果用试验样品与对照样品的比值来表示。计算其IC50值（50%抑制浓度）。

3.3细胞毒性分析试验

将3T3小鼠纤维瘤细胞或B16v小鼠黑色素瘤细胞以1x104细胞/孔（3T3）和2x104細胞/孔（B16v）的密度接种在96孔微孔板中。然后，在添加10%胎牛血清的DMEM培养基（3T3）或RPMI培养基（b16v）中，37℃和5%C02孵育24h，去除培养基，立即配制待测复方溶液和十二醇硫酸钠溶液（阳性标准品），在新鲜培养基（5%胎牛血清）中溶解，加入微孔板中，继续培养8h。然后去除培养基，用MTT（3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯四唑溴化铵）培养细胞2h。用异丙醇提取染料后，在570nm处测定其吸光度（a），并计算平均值和标准差。根据以下公式计算细胞活性：活性（%）=（一个试验物质/一个对照样品）X100%。

3.4对B16v细胞的色度分析试验

将B16v小鼠黑色素瘤细胞以5X10细胞/孔的密度接种于96孔微孔板中。再添加10%胎牛血清的RPMI培养基中，37℃，5%CO2孵育24h，再加入待测复合物溶液（溶剂：细胞培养液）和10nMα-MSH，培养96h。同样数量的培养基也被用于控制。用NaOH提取细胞中的黑色素后，在400nm处测量吸光度（a），计算平均值和标准差。黑色素合成抑制率计算公式如下：色素沉积抑制率（%）=100-[（试验品A/对照品）X100%]。

3.5在染色3D表皮模型上的分析试验

MelanoDermtmmel-300-b模型（皮肤类型IV，0.6cm2）在制造商提供的37°C和5%CO2的培养基中培养。将4-（1-苯乙基）-1，3-对苯二酚溶于磷酸盐缓冲液中，分别作用于模型表面（25μL/模型，2个表皮模型），得到0.01%或0.1%的溶液。对照组用纯磷酸盐缓冲液处理。试验化合物每天一次涂抹表皮模型，每隔一天更换培养基。待培养至规定时间后，用手术刀将表皮模型从插入物中分离，用Soluene溶剂（30min，60°C）提取，在400nm处测量上清液的吸光度，并与人工合成黑色素的吸光度进行定量分析黑色素含量。

为了测定细胞毒性，将表皮模型按上述方法分别培养在有或无试验化合物的情况下。14d，3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四苯唑（MTT）处理3D表皮模型3h，异丙醇提取染料，570nm处测定吸光度。

3.6体内法试验

在非辐照皮肤上进行体内试验：在12名亚洲受试者（皮肤类型为III）的背部每天处理2次（面积：12.5cm2），持续28天。测试阶段不允许紫外线照射。在第0天和第28天，通过视觉评分和色度计（L*值，MinoltaCR-300色度计，大阪，日本）评估皮肤颜色的变化。

3.7稳定性测试

将含有0.05%4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的水溶液在不同温度（5°C，室温，40°C）和pH5.0-9.0条件下培养12周，采用HPLC（HP1100，AgilentTechnologies，waldbronn，Germany）进行定量分析。

光稳定性试验中，将相应组分溶解于甘油中，配制成1%的溶液，分散在12片（20μL/片）上。4张玻片分别在阳光模拟器下照射2h和4h。另取4张作为对照。样品经辐照后提取，用高效液相色谱法定量。计算光降解率相对于对照物质（=100%）。

在色牢度测试中，制备含0.5%4-（1-苯乙基）-1，3-醌，含或不含0.5%二苯甲酮-3和0.1%EDTABD的油/水型标准洗剂（pH5.4），用紫外线300WsuntestCPS（Heraeus，Hanau，Germany）灯泡照射24小时，然后用色度计分析样品相对于安慰剂的颜色变化。褪色等级用辐照前后的值△b*表示。

04结果与讨论

在樟子松的乙醇提取物中，除了主要成分松香酸（一种常见于针叶树中的二萜）外，我们还发现了二苯乙烯衍生物3，5-二羟基二苯乙烯（赤霉素）和赤霉素-3-0-甲基醚（见图1）。这两种二苯乙烯衍生物可以用制备液相色谱法进行分离。但是，我们观察到赤霉素在紫外线照射下迅速分解（见表1）。

为了获得更稳定的增白靶点，我们通过双键加氢制备了相应的二氢化衍生物。这些化合物二氢chisin和二氢chisin-3-o-甲基醚也是松木[6]中微量的天然成分。光稳定性试验表明，与赤霉素相比，二氢赤霉素具有较高的光稳定性（见表1）。

4.1酪氨酸酶抑制

采用曲酸、对苯二酚和β-熊果苷混合，对松二苯乙烯和二氢二苯乙烯的类似物进行蘑菇酪氨酸酶抑制试验。赤霉素-3-O-甲基醚和二氢赤霉素-3-O-甲基醚均不活跃，说明3-OH在酪氨酸酶抑制中起主要作用。这些结果与ohguchietal.（2003A）[7]的检验相关，ohguchietal.（2003A）[7]发现与雷公藤素相比，雷公藤素-3，5-二甲醚对蘑菇酪氨酸酶没有抑制作用。有趣的是，二氢赤霉素对酪氨酸酶的抑制效果优于赤霉素（50%抑制浓度的IC50值为39.4μM和166.7μm），接近曲酸（IC50值为11.05μm）（见表2）。这一发现是ohguchi等人（2003A，b）的报告中没有预料到的[7，8]。他们的观点是二苯乙烯双键加氢后，其酪氨酸酶抑制活性明显降低。

遗憾的是，合成的二氢赤霉素采收率太低，不能用于进一步的开发。因此，我们合成了一些结构与二氢赤霉素非常接近的化合物，并对其进行了蘑菇酪氨酸酶抑制试验。4-苄基-1，3-对苯二酚的活性与曲酸相近（IC50分别为14.25μM和11.05μM），证实了二氢二苯乙烯能有效抑制酪氨酸酶活性的结论。2-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚对酪氨酸酶的抑制活性较弱（IC50值为258.93μM），这可能与间苯二酚基团的空间位阻有关。出人意料的是，4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚（IC50值为0.50μM）的活性甚至强于4-苄基-1，3-对苯二酚，是所有测试化合物中抑制效果最好的。对苯二酚和β-熊果苷在蘑菇酪氨酸酶抑制试验中表现出很弱的活性。这与之前发表的论文[9.10]的实验结果一致。

此外，4-（1-苯乙基）-1，3-对苯二酚也具有较强的抗光降解性。在非常严格的条件下（1%的甘油溶液涂在载玻片上，以40W/m2辐照4h，见表1），降解率仅为5%。将含5%4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的乙醇溶液置于玻璃容器中，用300W紫外灯照射24h（对应的辐射强度约为18W/m2）。经HPLC和GCMS分析（未显示），确认未发生降解。此外，如图2，4-（1-苯乙基）-1，3-对苯二酚在最大40°C和pH5.0—9.0条件下可以稳定6个月。

然而，即使是酚类化合物的轻微降解也可能导致成品化妆品配方中的变色。因此，我们比较了在不添加任何稳定剂、pH5.4的情况下，添加0.5%二苯甲酮-3和同时添加0.5%二苯甲酮-3和0.1%EDTABD的油/水标准配方的稳定性。如图3所示，在不添加任何稳定剂的公式1中，出现浅米色变色（△b*值：7.9）。二苯甲酮-3（配方2）明显减轻了变色情况（△b*值：1.8）。继续加入EDTABD（配方3）后，进一步得到了最佳的结果，在这种条件下△b*值仅为0.9。相对于白色安慰剂的这一细微的颜色差别，不再是肉眼可察觉的。

基于其优异的酪氨酸酶抑制活性和稳定性，利用体外法和体内法对（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的功效做进一步评价。

4.2细胞美白功效

接下来，我们研究了4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚降低B16v黑色素瘤细胞黑色素含量的能力。用4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚培养96h后，细胞内几乎没有黑色素。在所有研究的化合物中，4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚对黑色素合成的抑制作用最强，IC50值分别为67μM和440μM（见表3）。4-苄基-1，3-对苯二酚也表现出良好的细胞美白活性（IC50值=5.08μM）。赤霉素的活性仅与β-熊果苷相当，而二氢红素不活跃。我们还测试了市场上的一系列其他产品，如镁、维生素C、磷酸、肌酐、二酸和甘草（数据未列）。然而，在我们的细胞测试中，这些产品都没有显示出美白活性。

4.3对染色3D表皮模型的美白功效

B16v黑色素瘤细胞是一种小鼠细胞。因此，在研究活性物质对人体皮肤黑素生成的影响时，只是一个人工模型。此外，角化细胞分泌促黑素生成的ACTH肽α-MSH、内皮素-1等因子作为增效因子并通过吸收黑素细胞分泌的黑素小体在黑素生成中发挥重要作用。然后，我们研究了4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚相对于弯曲酸在染色的3D表皮模型（Melaniodermtm，皮肤IV型）上的美白效果。每天将含0.1%4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的磷酸盐缓冲溶液局部应用于3D表皮模型。7d后有明显的美白效果（未量化）。19d后，观察到黑色素的生物合成几乎完全被抑制（黑色素减少了95%）。相反，需要含有1.0%曲酸的磷酸鹽缓冲溶液来达到类似的效果（黑色素减少80%）。最初的深棕色模型几乎完全脱色（见图4）。仅含0.01%4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的磷酸盐缓冲溶液在培养19天后仍然可以使黑素皮层表皮组织的黑色素含量降低40%，这种效果肉眼可以清楚地观察到（变为浅棕色）。相比之下，0.1%的曲酸美白效果可以忽略不计。

这些结果在另一个实验中得到了证实。用0.1%的4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚溶液在染色的3D表皮模型上连续处理14d后，黑色素减少98%。14d采用MTT法进行细胞毒性试验，3D模型细胞活性不受影响。

4.4体内法评价4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的美白功效

为了证实4-（1-苯乙基）-1，3-醌在体内也有美白作用，我们在临床试验范围内考察了4-（1-苯乙基）-1，3-醌对亚洲受试者的皮肤是否有美白作用。在同一实验中，我们比较了两种含4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的水分散凝胶的效果。一种凝胶含油量为5.3%，另一种含油量为9.8%（见表4）。经比色仪测定，4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚相对0.5%比曲酸和安慰剂的1.0%有明显的美白效果（见图5）。从图中可以看出，4-（1-苯乙基）-1，3-二羟基酚的美白效果明显（A、B相对于安慰剂P<0.05），且优于曲酸（无统计学意义）。在含油量较低（5.3%）的配方中添加4-（1-苯乙基）-1，3-对苯二酚，效果更显著。

制备方法：将A相和B相分别加热至约80℃，然后将B相加入A相之中，并混合均匀。在叶片搅拌下加入C相。

在配方B中，FO24409先在中性油中预溶，再添加至油相B中。

05总结与展望

5.1关于SymWhite？？377的开发

二氢二苯乙烯和二苯甲烷衍生物是高效稳定的酪氨酸酶抑制剂。因此，它们是二苯乙烯衍生物美白剂的有价值的选择。通过高效液相色谱定量分析推断，二苯基甲烷衍生物4-（1-苯乙基）-1，3-对苯二酚在紫外照射下可以稳定存在，最高温度为40℃，pH为5—9。调节pH值至6.0以下，加入广谱UVA/UVB滤光剂二苯甲酮-3和金属螯合剂EDTABD，可以防止化妆品洗剂对4-（1-苯乙基）-1，3-醌的少量降解引起的变色。

特别是4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚是迄今为止报道的最有效的酪氨酸酶抑制剂之一。能有效降低b16v黑色素瘤细胞黑色素含量，并能染色3D表皮模型。未受照射的亚洲人皮肤经28d后，0.5%的4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚可显示显著的美白效果（比色计读数和视觉评分），其效果优于1.0%曲酸。当4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚应用于低含油量配方时，效果最显著。结果表明，4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚（Symwhite？？377）是一种有效、稳定、安全的皮肤增白剂。

5.2创新与美白的SymRadiance？388&399

基于对肤色改善靶点更全面的调控，德之馨在专利成分SymWhite？？377的基础上进行了全新的升级，并开发出SymRadiance？388、399两款全新成分。基于创新性的协同作用，SymRadiance？388、399在抗氧美白的基礎上把功效做的更全面，御氧抗皱，提亮肤色，最终更有效更全面提供肌肤亮白以及环境暴露导致的肤色暗沉问题。