基于种特异性SS-COⅠ技术快速鉴定瘤胫实蝇

黄 振 ， 郭琼霞

1福州长乐机场海关，福建 福州 350209； 2福州海关技术中心，福建 福州 350001； 3福建省检验检疫技术研究重点实验室，福建 福州 350001

瘤胫实蝇Bactroceratuberculata(Bezzi)是危害果蔬的重要害虫，被列入我国进境植物检疫性有害生物名录，属双翅目Diptera实蝇科Tephritidae果实蝇属Bactrocera果实蝇亚属Bactrocera(Drew,2007)。目前，主要分布在老挝(邓裕亮等，2010)、缅甸(肖枢等，2012)、不丹(Leblancetal.,2014)、中国的云南(Liangetal.,1993)等国家和地区。近年来，中边贸易频繁，进境果蔬种类和数量都在不断增加，邻国的老挝、缅甸等多为瘤胫实蝇疫区(陈鹏和叶辉,2009)，频繁的果蔬贸易给瘤胫实蝇的传入带来了潜在的危险(蒋小龙，2002)。

从多年口岸果蔬进境检疫的情况看，截获到的实蝇类害虫多以幼虫、卵或蛹等不同虫态出现。对实蝇的鉴定主要依据成虫的形态学特征编列出分类检索表进行分类检索鉴定，有时还需请专家进行鉴定复核，时效长；而对于幼虫的鉴定，需将幼虫饲养为成虫后再行鉴定，往往受到饲养时间和环境条件的限制，周期长，直接影响了国际果蔬贸易的快速通关。所以，传统的形态分类鉴定方法已经难以适应贸易性的果蔬携带的检疫性实蝇快速鉴定的要求。

近年来，随着分子生物学技术的发展，越来越多的分子鉴定技术被运用于昆虫的鉴定中(陈韶萍等，2014； 黄可辉等,2005)，可解决传统的形态学分类方法难以解决的幼虫等不同虫态的鉴定问题。为解决实蝇的幼虫、卵、蛹等未成熟虫态鉴定困难和周期长等问题，张亮和张智英(2007)采用RAPD技术构建了橘小实蝇B.dorsalisHendel、具条实蝇B.scutellata(Hende1)、黑漆实蝇B.scutellaris(Bezzi)、南瓜实蝇B.tau(Walker)、瓜实蝇B.cucurbitae(Coquillett)和番石榴实蝇B.correcta(Bezzi)等6种实蝇指纹图谱的快速鉴定方法；Chuaetal.(2010)采用PCR-RFLP技术，实现橘小实蝇复合种木瓜实蝇B.papayae和洋桃实蝇的鉴定。但RAPD技术对实验环境因子变化要求较为敏感，扩增产物的重复性和稳定性等较低；RFLP技术需通过检测内切酶识别位点的变异来确定昆虫种间亲缘关系和昆虫种属特异性，操作繁琐、多态性低，检出率不理想，所以，RAPD和RFLP技术的应用受到一定的限制。线粒体基因组由于具有基因组成稳定、基因排列相对保守、普遍为母系遗传、极少发生重组等特征，被广泛应用于分子进化、系统发育、物种鉴定、种群遗传结构及生物动力学等研究(Prabhakaretal.,2012)。不同类群的线粒体基因组表现出独特的特征与进化方式。在实蝇科昆虫研究中，基因序列的研究为实蝇类害虫的鉴定提供了大量分子生物学技术信息数据(Beardetal.,1993； Nardietal.,2010)。线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mtDNA COⅠ)基因的结构相对保守，排列的顺序比较稳定紧密，种间变异较大，容易被通用引物扩增，又有足够的特异性能将不同物种区分开，利用mtDNA COⅠ基因可以进行DNA条形码识别、近缘种间的比较鉴定和系统进化研究，已成为许多系统学研究的标准，mtDNA COⅠ是被应用于昆虫分子进化系统研究较多的标记基因之一(黄振等，2015)，也越来越多地被用到实蝇近缘种的系统发育研究中(范京安等，2009)。mtDNA COⅠ被作为一种快速进化的分子标记，已成为研究近缘种生物进化的重要材料(Jamnongluketal.,2003a,2003b)。

本研究采用种特异性引物SS-COⅠ( species-specific COⅠ)技术，基于mtDNA COⅠ基因序列，筛选设计目标物种特异性引物(张桂芬等，2012)，快速鉴定瘤胫实蝇，克服了对截获的疑似瘤胫实蝇的卵、蛹、幼虫、成虫及残体等不同虫态的鉴定困难，建立了一种利用分子手段快速鉴定瘤胫实蝇的可行性方法，为口岸快速通关和有效防治瘤胫实蝇提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试实蝇

本试验供试的虫样有果实蝇属果实蝇亚属9种：腿端黑实蝇B.atrifemurDrew & Hancock、杨桃果实蝇B.carambolaeDrew & Hancock、番石榴果实蝇、橘小实蝇、辣椒果实蝇B.latifronsHendel、锈红果实蝇B.rubiginaWang & Zhao、瑞丽果实蝇B.ruiliensis(Wang, Long et Zhang), sp.nov.、瘤胫实蝇和五指山实蝇B.wuzhishanaLin & Yang；镞果实蝇亚属Zeugodacus7种：近黑颜实蝇B.parater(Zhao & Lin)、二颜带实蝇B.ciliferaHendel、瓜实蝇B.cucurbitaeCoquillett、黑颜实蝇B.diaphoraHendel、黑膝实蝇B.scutellarBezzi、具条实蝇和南亚果实蝇B.tauWaiker;滇寡鬃实蝇B.modica、何氏华实蝇B.hochiiZin，以及Carpomya属枣实蝇C.vesuvianaCosta和Dacus属瓜棍腹实蝇D.longicornisWiedemann，共3属4个亚属20种实蝇。其中，腿端黑实蝇为2010年在福州机场进境旅客的携带水果中检疫截获，饲养为成虫后鉴定，为中国大陆首次截获(黄振等，2011)。另除杨桃果实蝇、番石榴果实蝇、橘小实蝇、辣椒果实蝇、瓜实蝇、具条实蝇、南亚果实蝇为口岸进境果蔬中截获，从卵、幼虫等饲养为成虫鉴定外，其余为诱捕剂诱到的实蝇，均为成虫，寄主无法确定。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取和质量检测 取已复核鉴定的瘤胫实蝇虫样的部分组织，采用OMEGA E.Z.N.A.TMInsect DNA Kit试剂盒提取各虫样基因组DNA。提取步骤按照试剂盒操作说明进行。提取的DNA通用引物：上游引物LCO1490碱基序列为5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′，下游引物HCO2198碱基序列为5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′。对提取的实蝇虫样基因组DNA进行质量检测，在定量梯度PCR仪上进行PCR反应。反应体系为：2×EasyTaq PCR SuperMix (天根生化科技有限公司)12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板各2 μL，加ddH2O至总体积25 μL。反应条件：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 40 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，最后一次循环后延伸10 min。分别提取5 μL PCR产物在含DNA染色剂的1.5%的琼脂糖凝胶多功能电泳仪上电泳30 min (120 V)，通过凝胶成像分析仪检测扩增，拍摄观察扩增条带的位置。

1.2.2 种特异性SS-COⅠ引物的设计 选用通用引物LCO1490和HCO2198对靶标实蝇提取的基因组DNA进行扩增并测序，由上海英潍捷基贸易有限公司进行测序，测序的序列为5′-CTGAGCTGGTATAGTAGGAACATCTCTTAGAATTTTAGTGCGAG

CAGAACTAGGACACCCGGGAGCCCTAATTGGCGA

TGATCAAATCTATAACGTAATTGTAACAGCCCATG

CATTTGTAATAATTTTTTTCATAGTTATACCTATTAT

AATTGGAGGATTCGGTAATTGATTAGTGCCTTTAAT

GCTAGGAGCCCCAGATATAGCATTCCCCCGAATAA

ATAATATAAGCTTTTGATTACTACCGCCCTCTCTCA

CATTACTTTTAACAAGCAGTATAGTAGAAAATGGA

GCTGGAACAGGCTGAACCGTTTATCCCCCCCTTTCT

TCTGCTATCGCCCACGGAGGAGCTTCTGTAGACTT

AGCTATCTTCTCATTACATTTAGCCGGAATCTCATC

CATTTTAGGAGCCGTAAATTTCATTACCACAGTTA

TTAATATACGATCAACCGGAATTACATTCGACCGT

ATACCTTTATTTGTTTGAGCAGTTGTATTAACAGCC

CTTCTTCTTCTACTTTCCTTACCAGTATTAGCTGGA

GCTATTACAATATTATTAACTGACCGAAATTTAAAT

ACTTCATTCTTCGACCCAGCAGGTGGAGGAGACCC

T-3′。将所测序列通过数据库(NCBI)比对查找瘤胫实蝇已公布的登录序列，并进行综合比较分析，最后选定登录号为KF659812，下载其登录号的FASTA格式，利用Primer-Premier 5.0进行人工筛选设计引物，再利用Oligo 6.44对引物进行评定和评价，最后利用NCBI数据库中提供的Primer-BLAST程序检查同源序列，筛选设计种特异性引物。最终选择的鉴定瘤胫实蝇的种特异性引物为LJF400和LJR564。引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成。特异性引物LJF400的序列为5′-ACTCTGTTTAGCCGGGATCT-3′；LJR564的序列为5′-CCGGCTAAAACTGATGGAGA-3′。

1.2.3 引物SS-COⅠ的种特异性的测试 选用瘤胫实蝇为阳性对照，其余的19种实蝇为阴性对照，设置反应的体系和条件，在定量梯度PCR仪上测试本试验所设计引物的种特异性。利用凝胶成像分析仪检测扩增出的目标片段。

1.2.4 引物SS-COⅠ的灵敏度测试 利用核酸蛋白分析仪对提取的瘤胫实蝇DNA模板的浓度进行测试，并将其DNA模板浓度按10-1、10-2、10-3倍3种梯度稀释，使用种特异性引物进行PCR扩增，测试引物的灵敏度。

1.2.5 引物SS-COⅠ的种特异性的验证 利用由云南口岸局提供的在我国云南边境监测到的瘤胫实蝇虫样，包括解剖到的果蔬中的幼虫(饲养到成虫并经过形态鉴定)等不同虫态虫样12份提取的DNA为模板，使用种特异性引物LJF400和LJR564进行PCR扩增，验证该方法的稳定性与准确性。

2 结果与分析

2.1 引物SS-COⅠ的种特异性测试

提取各虫样基因组DNA并进行质量检测，可见所有实蝇DNA均能扩增出约700 bp单一且清晰的目标条带(张桂芬等，2013)，结果见图1。

测试筛选设计引物的种特异性，结果表明：仅瘤胫实蝇在长度约165 bp位置扩增出一条清晰且单一的目标条带，其他19种实蝇种类均未出现任何条带(图2)。本试验对从西双版纳、海口、勐腊口岸3个口岸诱捕的瘤胫实蝇样本和阴性对照的19份实蝇样本的DNA模板重复试验3次，结果均一致，表明本试验筛选设计的种特异性引物LJF400和LJR564具有较强的特异性和稳定性。

得到的PCR产物经上海英潍捷基贸易有限公司测序，将测序所得到的序列提交数据库(NCBI)经BLAST检查同源序列，结果表明：该段序列与数据库中的瘤胫实蝇序列具100%的一致性。

图1 采用通用型引物LCO1490和HCO2198对20种实蝇提取的DNA模板的质量检测结果Fig.1 Common primers LCO1490 and HCO2198 used to detect the quality of DNA templates extracted from 20 kinds of flies M：100 bp DNA ladder:1:瘤胫实蝇；2:洋桃果实蝇；3:番石榴果实蝇；4:橘小实蝇；5:辣椒果实蝇；6:锈红果实蝇；7:瑞丽果实蝇； 8: 腿端黑实蝇；9:五指山实蝇；10:二颜带实蝇；11:瓜实蝇；12:黑颜实蝇；13:近黑颜实蝇；14:黑膝实蝇；15:具条实蝇； 16:南亚寡鬃实蝇；17:滇寡鬃实蝇；18:何氏华实蝇；19:瓜棍腹实蝇；20:枣实蝇；21：空白对照。 M： 100bp DNA ladder:1: B. tuberculata； 2: B. carambolae； 3: B. correcta； 4: B. dorsalis； 5: B. latifrons； 6: B. rubigina； 7: B. ruiliensis； 8: B. atrifemur； 9: B. wuzhishana； 10: B. cilifera； 11: B. cucurbitae； 12: B. diaphora； 13: B. parater； 14: B. scutellaris； 15: B. scutellata； 16: B. tau； 17: B. modica； 18: B. hochii； 19: D. longicornis； 20: C. vesuviana； 21： ddH2O.

图2 瘤胫实蝇引物LJF400和LJR564的种特异性测试Fig.2 Test of species-specificity of primers LJF400 and LJR564 for B. tuberculata M：100 bp DNA ladder:1:瘤胫实蝇；2:洋桃果实蝇； 3:番石榴果实蝇；4:橘小实蝇；5:辣椒果实蝇；6:锈红果实蝇；7:瑞丽果实蝇； 8:腿端黑实蝇；9:五指山实蝇；10:二颜带实蝇；11:瓜实蝇；12:黑颜实蝇；13:近黑颜实蝇；14:黑膝实蝇；15:具条实蝇； 16:南亚寡鬃实蝇；17:滇寡鬃实蝇；18:何氏华实蝇；19:瓜棍腹实蝇；20:枣实蝇；21：空白对照。 M：100 bp DNA ladder:1: B. tuberculata； 2: B. carambolae； 3: B. correcta； 4: B. dorsalis； 5: B. latifrons； 6: B. rubigina； 7: B. ruiliensis； 8: B. atrifemur； 9: B. wuzhishana； 10: B. cilifera； 11: B. cucurbitae； 12: B. diaphora； 13: B. parater； 14: B. scutellaris； 15: B. scutellata； 16: B. tau； 17: B. modica； 18: B. hochii； 19: D. longicornis； 20: C. vesuviana； 21： ddH2O.

2.2 引物SS-COⅠ的灵敏度测试

利用核酸蛋白分析仪提取的瘤胫实蝇DNA模板的浓度,测试结果为55.97 ng·μL-1。将其稀释至3种不同梯度浓度后，进行DNA模版最低阈值的测定，结果在原浓度稀释10-1倍后，仍可见有明显条带(图3)，说明该引物具有较高的灵敏度。

2.3 引物SS-COⅠ的种特异性的验证

取瘤胫实蝇虫样：西双版纳瘤胫实蝇8份、海口瘤胫实蝇2份、勐腊瘤胫实蝇2份，共12份实蝇提取的DNA模板进行种特异性测试验证，均显示出目标条带。结果表明：本试验SS-COⅠ种特异性引物可以快速鉴定靶标实蝇瘤胫实蝇，鉴定结果与形态学鉴定结果一致(图4)，验证结果也表明SS-COⅠ引物具有较强的特异性和稳定性，可以应用于瘤胫实蝇的鉴定。

图3 瘤胫实蝇引物LJF400和LJR564的 灵敏度测试Fig.3 The sensitivity test of the primers LJF400 and LJR564 of B. tuberculata M：100 bp DNA ladder;1：100;2：10-1倍;3：10-2倍; 4：10-3倍;5：空白对照。 M： 100 bp DNA ladder； 1： 100； 2： 10-1 times； 3： 10-2 times； 4： 10-3 times； 5： ddH2O.

图4 瘤胫实蝇的种特异性引物(SS-COⅠ) 验证结果Fig.4 Verification results of SS-COⅠ for B. tuberculata M：100 bp DNA ladder；1～8：西双版纳瘤胫实蝇；9～10： 海口瘤胫实蝇；11～12：勐腊瘤胫实蝇；13：空白对照。 M：100 bp DNA ladder； 1-8: B. tuberculata of Xishuangbanna； 9-10： B. tuberculata of Haikou； 11-12： B. tuberculata of Mengla； 13： ddH2O.

3 讨论

3.1 引物的特异性是鉴定靶标实蝇的关键

本试验选用线粒体基因mtDNA COⅠ作为标记基因，研究筛选设计了特异性引物LJF400和LJR564，测试监测到的瑞丽果实蝇、滇寡鬃实蝇和口岸进境果蔬中检疫截获的20种的实蝇虫样，并对西双版纳、海南海口和勐腊口岸诱捕监测的瘤胫实蝇的成虫和成虫的腿节、翅膀等残体共12份提取到的DNA模板进行PCR扩增、测试验证，仅瘤胫实蝇能稳定地扩增出一条长度约165 bp的单一且清晰的特异性目标条带，其他19种实蝇均无任何条带发现，验证了本试验筛选设计引物的种特异性，表明引物的特异性是鉴定靶标实蝇的关键。

3.2 应用种特异性SS-COⅠ引物建立快速鉴定方法的可行性

近年来，分子标记技术发展迅速，也逐步被应用于实蝇类害虫不同虫态的鉴定。本研究基于mtDNA COⅠ基因技术，设计靶标瘤胫实蝇种特异性SS-COⅠ引物，对18个同属近缘种和其他属2种共20种实蝇样本进行鉴定，时间只需8 h，解决了口岸在进境果蔬中截获的幼虫虫态实蝇，需要饲养至成虫后进行形态鉴定的周期长和饲养环境条件局限等存在的问题。研究表明：检测到的DNA模板浓度可低至5.597 ng·μL-1，用量低，且具有较高的灵敏度。可见，建立的SS-COⅠ种特异性引物的检测方法，只要能提取到DNA，就能实现对靶标种的鉴定，用时短，快速准确，并具有可行性。

实蝇科昆虫具有重要经济意义，种类多，目前已完成线粒体基因组测序的实蝇科种类只有3属l4个物种(姜帆等，2016)，更多实蝇科昆虫种类的线粒体基因组序列的分析研究有待进一步深入。应用特异性引物SS-COⅠ检测技术快速鉴定，不仅适用于不同虫态实蝇的鉴定，也能利用实蝇成虫的残体部分，如腿节残肢、翅膀等，提取到微量的DNA，即可快速鉴定，该方法为其他实蝇的种特异性引物检测技术的研究提供了参考，对开展和促进进境果蔬的实蝇检疫鉴定有着积极的作用和现实意义。