饲料中霉菌毒素污染检测技术研究进展

2022-05-30黄金耒李斌贾楠郎冲冲孙文姜林

中国奶牛 2022年5期

黄金耒，李斌，贾楠，郎冲冲，孙文，姜林

（北京市农林科学院智能装备技术研究中心，北京 100097）

霉菌毒素，又名真菌毒素，是霉菌在生长成熟过程中产生的一系列有毒有害物质。霉菌毒素对饲料的污染较为普遍和严重，美国食品和药物管理局（FDA）调查研究显示，全球约有25%的饲料及其原料受到霉菌毒素的污染[1]。霉菌毒素的产生与温度和湿度有关，可发生在生产加工、储存和运输等饲料生产的任一环节。摄入含有霉菌毒素的饲料会降低畜禽免疫机能，引起多种疾病，影响畜禽正常生长及生产性能，并最终通过畜牧产品食物链危害人类健康；且研究显示微量的霉菌毒素对畜禽/人就有着极大的毒害作用[2～4]。因此，快速、准确地检测饲料产品及原料中霉菌毒素的含量，是保障动物健康生长和人类食品安全的必要手段。

近年来，国内外学者已经开展了霉菌毒素的检测方法研究，并取得一定进展。鉴于此，本文简要介绍霉菌毒素及检测标准，综述了多种基于生物理化和光谱分析的检测方法，从而为定性定量检测霉菌毒素的应用研究提供参考。

1 常见霉菌毒素及检测标准

饲料中常见的霉菌毒素种类有单端孢霉烯族毒素（T-2毒素）、赭曲霉毒素、黄曲霉毒素（AFT）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和伏马毒素（FB）等。霉菌毒素对动物和人类的危害主要表现为免疫抑制性、致畸性和致突变性，还会导致肾脏中毒、神经系统异常及致癌等。同时存在多种霉菌毒素时毒性加重，如T-2毒素与赭曲霉毒素A（OTA）、呕吐霉素（DON）与AFT、DON与ZEN之间具有协同作用[5]。

在我国国家标准及行业标准中，已给出几种霉菌毒素检测方法，包括检测AFB1的酶联免疫吸附测定（ELISA）方法，检测AFT、ZEN以及T-2毒素含量的液相色谱-串联质谱测定方法，检测DON含量的免疫亲和柱净化-高效液相色谱测定方法，检测OTA含量的免疫亲和柱净化-高效液相色谱测定方法，检测FB1+FB2含量的液相色谱串联质谱测定方法和液相色谱测定方法。但这些检测方法或多或少存在一定的局限性，如酶联免疫吸附法虽操作简便，但成本高且耗时长[6]；免疫亲和柱净化-高效液相色谱测定方法灵敏度高，但仪器昂贵且操作复杂[7]。因此，研发快速、步骤简化、材料节省的定性定量检测方法成为了迫切需求。

2 基于生物和理化技术的霉菌毒素检测方法

随着生物和理化技术的发展，一些快速检测技术逐步应用在霉菌毒素方面，主要有免疫层析法、薄层色谱法、超快速液相色谱法，以及核酸适配体生物传感器法等。

免疫层析法（ICA）是基于标记的特异性抗体与抗原的相互作用的检测方法[8]，具有快速、准确、可视化和适合大批量检测等优点，但敏感度较差。Urusov等[9]建立了检测粮食中污染物OTA的免疫层析系统，检测水平分别为50ng/mL和5ng/mL的粗植物提取物，检测时间为10min。

薄层色谱法（TLC）是利用混合物中溶剂的吸附或溶解性能的不同对霉菌毒素进行提取、分离的一种检测方法[10]，具有操作简单、可靠，以及良好的重现性。由于TLC需要稳定的溶剂和标准供应，以及严格的储存条件，检验过程繁琐，一般多用于霉菌毒素的仲裁检验。目前，我国国标方法针对饲料中AFB1半定量、配合饲料中T-2毒素和DON、谷物和大豆中OTA仍然采用此方法进行检测。

超快速液相色谱法（UPLC）是一项快速的分析分离技术，具有使用方便、灵敏度高和选择性多等优点[11]。Liu等[12]建立了一种超快速液相色谱与混合三重四极杆/线性离子阱串联质谱（UPLC-QqQLIT-MS/MS）联用方法，用于同时检测白术中7种真菌毒素，检测和定量限分别达到0.025～0.25μg/kg、0.100～0.50μg/kg。该方法具有分析时间短、耗时少、溶剂消耗少、灵敏度高等显著优势，是复杂基质中多类真菌毒素经济分析的首选方法，但检测仪器包括多个模块，价格昂贵，增加了维修难度和成本。

适配体是具有高特异性和靶标结合亲和力的单链DNA或RNA分子，可与多种目标物质高选择性地结合，常用于检测低分子量的物质，广泛应用于生物传感器领域[13]。基于核酸适配体生物传感器法具有易修饰、易合成、灵敏度高、易标记、特异性高、分子质量小、检测成本低等优势[14]。Yue等[15]设计了一种新型光子晶体编码悬浮阵列适配体，可同时量化和鉴定谷类样品中的OTA和FB1，具有较广的线性检测范围（OTA为0.01～1ng/mL，FB1为0.001～1ng/mL）和低检测限（OTA为0.25pg/mL，FB1为0.16pg/mL）。在添加谷物样品中，OTA的回收率为81.80%～116.38%，FB1的回收率为76.58%～114.79%，自然污染的谷物样品中阳性检测结果与经典的酶联免疫吸附试验结果一致。

另外，还有一些正在快速发展的快检技术，在检测饲料中霉菌毒素方面有一定的研究潜力，表1介绍了5种新型快检技术的检测原理、检测目标物、精度及优缺点。

表1 饲料中霉菌毒素主要快检方法

上述介绍的方法近年来发展较快，并且在某些领域得到了初步应用，有些甚至被列为国家标准，但其仍存在一定的局限性。例如，样品制备方法复杂，测试结果取决于检查员的经验和技术知识，适用性较差等。

3 基于光谱技术的霉菌毒素检测方法

近年来，光谱分析技术应用于霉菌毒素检测得到越来越多的业界关注。光谱技术，包括近红外反射（NIR）、拉曼光谱（RAM）和太赫兹时域光谱（THz-TDS）等技术，可通过单次扫描提供与真菌毒素成分及其结构相关的定性定量信息，具有样品制备简单、测量快速、可原位测量等优点。

3.1 近红外光谱技术

现代光谱放大和增强技术的出现使近红外和傅里叶变换红外光谱能够检测和识别谷物和油籽中的真菌种类和真菌毒素。相关学者运用化学计量学方法，先后开展了小麦和玉米中真菌毒素的浓度预测研究[21,22]。

Carames等[23]扫描大麦样品得到近红外光谱数据，结合偏最小二乘判别分析（PLS-DA），以1 250μg/kg为阈值区分大麦的DON污染水平，并验证了偏最小二乘回归（PLS-R）预测大麦样品中DON浓度的性能。结果表明，大麦中DON的校准均方根误差RMSEC=101.94μg/kg，预测均方根误差RMSEP=160.76μg/kg。蒋雪松等[24]通过在线获取自然感染赤霉病的小麦粉近红外光谱数据，以1 000μg/kg为界限，分别用线性判别分析（LDA）与偏最小二乘回归（PLS-R）建立小麦粉样品的定性分析模型和定量分析模型，结果表明，小麦粉DON含量超标与否的最佳识别率达87.69%，表明判别模型具有较好的精确度。但定量分析的结果不太理想，预测集相关系数只有0.688。张强等[25]采集了稻谷样本的近红外光谱信息，以径向基函数（RBF）为核函数的支持向量机参数对采集到的光谱数据建模，用以测定储存稻谷中AFB1含量。结果表明，该模型校正集决定系数为0.913，校正标准偏差和预测标准偏差分别为1.186和1.267，由此可见，基于支持向量机算法建模可准确检测稻谷中AFB1；但近红外吸收带不能很好地分辨与其他成分重叠部分[26]。

3.2 拉曼光谱技术

拉曼光谱技术对非极性基团中共价键的对称振动敏感。关于真菌毒素化合物及其衍生物的化学官能团，由于其对水的不敏感性和较少的重叠带，拉曼光谱通过提供对真菌毒素的分子水平观测，提供了比传统光谱技术更有价值的定性定量信息。相关研究表明[27]，基于拉曼技术的谷物和油籽等产品中真菌毒素污染检测准确率较高。

杨雪倩等[28]以6个不同霉变等级的玉米样品为研究对象，开展了拉曼光谱检测研究，通过对原始拉曼光谱数据进行预处理和特征波长的提取，建立了玉米ZEN和AFB1含量的定量预测模型。结果表明，基于筛选的特征波长光谱信息所建立的BP神经网络（BPNN）模型预测效果最佳。这为拉曼光谱技术用于霉变玉米真菌毒素的快速、准确检测提供了方法借鉴。目前，在拉曼光谱方面，特征提取建模方法有待进行深入研究，从而建立更加稳定的定量预测模型。

3.3 太赫兹光谱技术

太赫兹光谱是20世纪80年代以来发展迅速的一项新的光谱技术，由于具有低能性、高分辨率和强穿透性等优点被认为是最有前途的检测方法之一[29,30]。

廉飞宇等[31]从污染的玉米样品中提取AFB1，然后利用太赫兹时域光谱系统采集信息，利用一种改进的多重D-S（Dempster-Shafer）证据理论对AFB1溶液的含量进行了识别，正确识别率达到94%。Ge等[32]将AFB1标准溶液配置在浓度范围为1～50μg/mL和1～50μg/L的乙腈溶液中，用太赫兹光谱获取数据，利用160个样品的吸收光谱和线性/非线性浓度建立了回归模型，对AFB1溶液定量分析，结果表明，偏最小二乘法（PLS）和主成分回归（PCR）模型在1～50μg/mL的浓度范围内更为准确，而支持向量机（SVM）和主成分分析-支持向量机（PCA-SVM）方法在1～50μg/L的浓度范围内更为准确。Liu等[33]对大豆油中AFB1的浓度进行了定量预测，研究了检测限，构建了相关检测模型，结果表明，模型能较好地区分2μg/kg以上AFB1浓度的大豆油和纯大豆油，预测准确率达90%以上。张成等[34]设计加工了圆形阵列的双开口环超材料生物传感器，并对AFB1和AFB2进行检测，通过THz-TDS实验和有限元模拟仿真，研究了AFB1和AFB2的透过图谱在超材料结构共振频率下相对透过强度的偏移和中心共振频率的偏移，结果模拟结果与实验数据较为吻合，较好地揭示了沉积黄曲霉毒素膜的传感响应机理，该研究表明太赫兹超材料生物传感器能够以10～8mol量级实现AFB1和AFB2的高灵敏度、无标记、无损检测。太赫兹检测方法在快速、准确、无损实现AFB1定性定量检测方面呈现出良好潜力。