角质酶在涤纶织物表面改性中的应用

王艳萍， 陈晓倩， 夏 伟， 傅佳佳， 高卫东， 王鸿博， ARTUR Cavaco-Paulo

(1. 江南大学 江苏省功能纺织品工程技术研究中心， 江苏 无锡 214122； 2. 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室， 江苏 无锡 214122； 3. 米尼奥大学 生物工程中心， 葡萄牙 布拉加 4710-057)

涤纶是当前应用最广、产量最高的合成纤维之一，其在化纤总产量中的占比稳定在80%以上[1-2]。涤纶强度较高，具有耐磨、耐拉伸、机可洗、抗皱等诸多优良特性,但涤纶大分子中无活性基团，回潮率偏低，在标准大气压下为0.4%，这使得涤纶织物的亲水性、染色性、透气性及抗静电性均较差[3-4]，影响其服用舒适性。

当前，一般可通过化学处理(如氧化剂氧化法、表面水解法等)、物理涂层、表面接枝改性(如化学引发接枝改性和辐射接枝改性)等技术实现对涤纶织物亲水性能的改善[5-7],但这些方法需用到刺激性化学试剂或需高能量的输入，处理过程对环境不友好且繁琐。辐照处理(如低温等离子体处理)的涤纶织物具有时效性，短期内易恢复疏水性[4,8-9]；碱减量处理需消耗大量碱和水，产生废水，污染环境，且处理后纤维性能受到损伤，导致织物力学性能下降，影响其服用性能[4,6,10]。相比之下，采用生物酶法进行涤纶织物的表面改性，处理条件温和，节能、节水，处理过程绿色生态环保，且酶作用仅限制在涤纶表层，不损坏纤维本身的性能[11]。

涤纶织物生物酶法亲水改性所用的酶制剂大都是脂肪酶和角质酶，都属于酯酶，这2种酶对涤纶酯键起到催化水解作用，在纤维表层生成亲水基团，达到亲水化改性效果，且同时可维持纤维自身较好的物理力学性能[12-14]。相较于脂肪酶，角质酶的活性中心无盖子结构，这使其活性中心更容易结合底物，因此，本文选用热稳定性好且活力较高的H.insolens角质酶对涤纶织物进行表面改性，探究酶用量、反应时间、反应pH值、温度以及非离子型表面活性剂Trition X-100等对改性效果的影响。通过定量测试反应体系中对苯二甲酸(即TPA)及其衍生物的释放量，结合高效液相色谱(HPLC)、扫描电镜(SEM)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)等分析技术以及水接触角、亚甲基蓝染色性能测试，评价涤纶织物酶法改性的效果。

1 实验部分

1.1 实验材料

100%涤纶平纹织物，经、纬纱线密度均为2.22 tex，经、纬密分别为880、680根/(10 cm)，面密度为56 g/m2，由吴江市中鹏纺织有限公司提供。

H.insolens角质酶(特异腐质霉来源角质酶)，食品科学与技术国家重点实验室(江南大学)；对硝基苯丁酸酯(pNPB)，Sigma-Aldrich公司;对苯二甲酸(TPA，分析纯)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、碳酸钠、无水乙醇、十二烷基硫酸钠(SDS),国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验仪器

TG16.5型高速离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司),P5型紫外-可见分光光度计(上海美普达仪器有限公司),TU-1900型双光束紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器公司),GZX-9146 MBE型电热鼓风干燥箱、BSD-YF2200型立式双层精密摇床(上海博讯实业有限公司),Nicolet is 10型傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo Fisher公司),Datacolor 650型测色配色仪(美国Datacolor公司),SU1510型扫描电子显微镜(日本日立公司),BHS-4型数显恒温水浴锅(江阴保利科研机械有限公司),1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司),DSA 25接触角测量仪(德国KRUSS公司)。

1.3 织物前处理

将涤纶织物按照浴比为1∶30，浸没在含有5 g/L皂片、4 g/L碳酸钠的溶液中，在98 ℃条件下处理30 min，达到精练效果。然后用去离子水清洗，平铺在培养皿中，置于烘箱中，在105 ℃下烘干。最后将处理后织物放入恒温恒湿箱，在温度为(21±1) ℃和相对湿度为(65±2)%的条件下平衡至少24 h，以备后续实验使用。

1.4 织物酶处理

将质量为0.4 g的涤纶织物，按1∶40浴比放入Tris-HCl缓冲液(pH值 8.0，浓度5 mmol/L)中，取一定剂量的角质酶加入上述处理液中。将整个反应体系用封口膜密封，放在60 ℃，150 r/min的恒温摇床培养箱中反应。将酶处理后的涤纶织物在超声波作用下，分别采用1%SDS和20%无水乙醇各清洗30 min，然后放入烘箱中，在105 ℃下烘干。将烘干后的涤纶织物置于恒温恒湿箱中，在温度为(21±1) ℃和相对湿度为(65±2)%条件下平衡至少24 h，以备后续测试使用。其中，处理织物的对照样是在相同条件下用缓冲液代替酶液处理的涤纶织物，反应残液的对照样是在相同条件下仅加酶而未加涤纶织物的反应液。

1.5 测试方法

1.5.1 角质酶活性测定

采用连续紫外-可见分光光度计测定角质酶的活力[15]。酶活性测定反应体系中含有酶液(适度稀释)和对硝基苯丁酸酯(pNPB，50 mmol/L)各30 μL，Tris-HCl缓冲液(pH值 8.0，浓度5 mmol/L)1 440 μL，即总反应体积为1.5 mL。在波长为405 nm处测定对硝基酚(pNP)的生成速率，并定义温度设为37 ℃时，每分钟催化pNPB水解生成1 μmol对硝基苯酚pNP的酶量即为1个酶活力单位U。

1.5.2 涤纶织物水解产物释放量测定

涤纶经酶催化水解生成的产物对苯二甲酸(TPA)及其衍生物在波长240 nm处会出现吸收峰，因此，可通过紫外-分光光度计测定体系中TPA及其衍生物的生成量来评价酶对涤纶改性的效果。通常可能的酶解产物有TPA、单(对苯二甲酸-2-羟基乙酯)(MHET)、二(对苯二甲酸-2-羟基乙酯)(BHET)。由于这3种产物的羰基基团产生的摩尔吸光系数相同，因此可利用TPA的标准曲线来计算产物的释放总量，参照文献[16]绘制TPA的标准线如图1所示。

图1 TPA质量浓度与吸光度标准曲线Fig.1 Standard curve of TPA concentration and absorbance

由图1可知，标准曲线的拟合方程为

A=1.289 97×10-4+4.127 91C

式中：A为测试样品在240 nm处紫外光谱吸光度；C为TPA的质量浓度，mg/mL。相关系数为R2=0.999 76。

在测定体系中产物生成量时，需将反应残液在沸水中放置30 min，使角质酶失去活力。然后离心(8 000 r/min,10 min)，取上清液作为产物释放量的测试样。参照样为相同条件下仅加角质酶未加涤纶织物的处理体系反应残液，经过酶失活、离心所取的上清液。测定反应残液在240 nm波长下的吸光度，每组样品测试3次。

1.5.3 涤纶织物水解产物种类鉴别测试

采用的反向色谱柱是Athena C18-WP(100 A，4.6 mm×250 mm，5 μm)。流动相为体积比为35∶65的1%冰乙酸/甲醇溶液，进样量为5 μL，流速为0.5 mL/min，色谱柱保持在30 ℃，在240 nm波长下进行分析。

1.5.4 表面形貌观察

采用扫描电子显微镜观察角质酶处理前后涤纶织物形貌变化。设置加速电压为5.0 kV。

1.5.5 涤纶织物化学结构表征

采用傅里叶变换红外光谱仪对角质酶处理前后涤纶织物表面进行全反射红外光谱测试，扫描次数为32次，扫描范围为4 000～500 cm-1。

1.5.6 涤纶织物亚甲基蓝染色性能测试

亚甲基蓝是碱性染料，具有吸附在—COO-基团上的特性，可用于测定涤纶表面—COOH基团数量的变化。分别对角质酶处理后的涤纶织物及未处理涤纶织物进行染色，染色工艺为：亚甲基蓝染料用量0.5%(o.w.f)，浴比1∶100，置于恒温摇床振荡箱中，在60 ℃和150 r/min条件下染色2 h。随后用去离子水冲洗样品，并在室温下进行干燥。

使用测色配色仪中软件(Datacolor TOOLS Plus)评价酶处理前后涤纶织物的染色性能。三刺激值X、Y和Z是可见区域内通过标准观测仪(10°)在光源D65下进行测定的，波长范围设定为360～700 nm，基于最大吸收波长(λmax)处的反射率计算测试样品的K/S值。

1.5.7 织物水接触角测试

在距布面10 mm处滴下10 μL去离子水液滴，通过接触角测量仪分析软件记录样品接触角。同一样品选取5个不同位置进行测量，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 角质酶催化水解反应的影响因素

2.1.1 角质酶用量对水解效果的影响

在温度为60 ℃，时间为48 h，pH值为8.0的反应条件下，考察角质酶用量与TPA及其衍生物释放量的关系，结果如图2所示。H.insolens角质酶催化水解涤纶织物的产物(即TPA及其衍生物)释放量随着酶用量的增加而增加。当体系中酶用量高于100 U/mL时，由于涤纶表面没有足够多的作用位点与角质酶的活性位点结合，加之角质酶是大分子，无法进入表面较致密的涤纶内部反应，因此角质酶的催化效率开始下降，TPA及其衍生物释放量不再增加。

图2 角质酶用量对TPA及其衍生物释放量的影响Fig.2 Influence of cutinase dosage on release of TPA and its derivatives

2.1.2 反应时间对水解效果的影响

在温度为60 ℃，酶用量为100 U/mL，pH值为8.0的条件下，考察反应时间与TPA及其衍生物释放量的关系，结果如图3所示。反应初期，H.insolens角质酶催化水解涤纶织物的产物(即TPA及其衍生物)释放量随反应时间的延长而快速增长。相关研究中曾报道采用毕赤酵母来源脂肪酶催化水解涤纶织物7 h时，生成的产物量达到稳定饱和值，为12.5 mg/L[10]，而图3所示采用H.insolens角质酶处理涤纶织物6 h时，生成的产物量可达17.2 mg/L。反应前72 h，产物释放量随时间的延长而显著增长；反应72 h后，产物生成量高达119.6 mg/L，继续延长反应时间，产物释放量的增长趋于平缓。可见，该酶对涤纶作用效果显著。

图3 反应时间对TPA及其衍生物释放量的影响Fig.3 Influence of reaction time on release of TPA and its derivatives

角质酶对涤纶内部酯键的可及度较低，随着反应时间的延长，涤纶表面可被水解的酯键的数量变少，因此酶水解生成的产物量增加趋势变缓。此外，角质酶的活力也随着时间的延长逐渐下降，加之可能的产物抑制作用，使得角质酶的催化效率也会降低。

2.1.3 反应pH值对水解效果的影响

在温度为60 ℃，酶用量为100 U/mL，反应时间为48 h的反应条件下，考察反应pH值与TPA及其衍生物释放量的关系，结果如图4所示。H.insolens角质酶催化水解涤纶织物的产物(即TPA及其衍生物)释放量随反应pH值的增加呈先增加后减少的变化趋势。当pH值为8.5时，反应体系中产物的释放量最大。酶的活力即其催化反应的能力会受到pH值的影响，这是因为pH值变化直接影响酶活性中心基团的解离程度，进而活性中心与底物的结合和催化作用受到影响；因此，只有当体系的pH值设定为酶促反应最适pH值时，酶分子构象稳定，其活性中心处在与底物结合和催化最适宜的状态，催化反应能力最强。偏离酶催化反应最适pH值后，角质酶催化酯键水解会受到限制。

图4 反应pH值对TPA及其衍生物释放量的影响Fig.4 Influence of pH on release of TPA and its derivatives

2.1.4 反应温度对水解效果的影响

在酶用量为100 U/mL，反应时间为48 h，pH值为8.0的条件下，考察反应温度与TPA及其衍生物释放量的关系，结果如图5所示。

图5 反应温度对TPA及其衍生物释放量的影响Fig.5 Influence of reaction temperature on release of TPA and its derivatives

H.insolens角质酶催化水解涤纶织物的产物释放量(即TPA及其衍生物的量)随反应温度增加呈先增加后减少的变化趋势。当反应温度为60 ℃时，反应体系中产物的释放量最大。温度对酶的活力即其催化反应的能力具有双向影响。一方面，温度升高，有利于化学反应加速进行，酶催化反应速度也随之加快，从这个角度看，温度升高可增大酶的催化活力，当温度达到酶的最适温度时，其具有最高催化活力；另一方面，温度升高会影响酶蛋白性状，反应温度过高，酶蛋白质容易变性，会造成酶活力降低甚至丧失，酶的作用效果受到限制。

2.1.5 表面活性剂对水解效果的影响

在H.insolens角质酶用量为100 U/mL，温度为60 ℃，反应时间为72 h，pH值为8.5的条件下，考察表面活性剂Trition X-100对产物(即TPA及其衍生物)释放量的影响，测得Trition X-100、角质酶、角质酶+Trition X-100条件下TPA及其衍生物的释放量分别为10.39、120.85、285.7 mg/L。可见，在体系中加入0.1%的表面活性剂Trition X-100，产物释放量较未加入时提高了136%。这是因为表面活性剂Trition X-100分子中含有疏水基团和亲水基团，在反应过程中，表面活性剂分子中的疏水基团与涤纶的疏水表面相结合，而表面活性剂分子中的亲水基团向外延伸，可有效吸引酶蛋白分子，因此，表面活性剂Trition X-100的加入为疏水的涤纶和亲水的酶分子提供“桥梁”，有利于酶分子靠近并吸附在涤纶表面，提升角质酶对涤纶织物的催化效率，使得产物的释放量显著增加。

2.2 涤纶织物水解产物种类分析

在H.insolens角质酶用量为100 U/mL，时间为72 h，pH值为8.5，温度为60 ℃，同时加入0.1%表面活性剂Trition X-100的反应条件下，对反应残液进行高效液相色谱分析，以鉴定水解产物的种类，结果如图6所示。

图6 酶处理涤纶织物反应残液高效液相色谱图Fig.6 High performance liquid chromatography diagram of residual reaction liquid from enzymatic treatment of polyester fabric

TPA和MHET对应出峰时间分别是27.21和30.08 min。用H.insolens角质酶处理涤纶织物时，产物中检测到相当量的TPA和MHET，而未检测到BHET，这与先前文献[12]报道的结果一致。

2.3 织物表面形貌分析

图7示出H.insolens角质酶处理前后涤纶织物的扫描电镜照片。可看出，酶处理前涤纶织物表面光滑，酶处理后织物表面变得粗糙，出现不同程度的刻蚀，这是由于酶催化涤纶表面结构较疏松的无定形区内酯键水解造成的。酶催化涤纶水解的作用仅限于纤维表层，不会过度损坏涤纶的力学性能。

图7 角质酶处理前后涤纶的扫描电镜照片(×10 000)Fig.7 SEM images of polyester before (a) and after (b) cutinase treatment

2.4 涤纶织物表层化学结构分析

图8 角质酶处理前后涤纶织物的红外光谱图Fig.8 Infrared spectrum of polyester fabric before and after cutinase treatment

2.5 涤纶织物亚甲基蓝染色性能分析

角质酶对涤纶织物的水解反应体现在酶催化涤纶织物表面酯键断裂生成羟基(—OH)和羧基(—COOH)。亚甲基蓝色染料可用于测定吸附在涤纶上的—COOH基团数量。图9示出角质酶处理前后涤纶织物的K/S值变化情况。可看出，在550～650 nm范围内角质酶处理后织物的K/S值增加显著，证实了角质酶可催化涤纶织物发生水解反应。酶处理后涤纶织物的K/S值增加，说明涤纶织物水解后羧端基增多，导致涤纶织物表面亚甲基蓝染料的吸附显著增加。

图9 角质酶处理前后涤纶织物的K/S值曲线Fig.9 K/S curve of polyester fabric before and after cutinase treatment

2.6 织物水接触角分析

图10示出角质酶处理前后涤纶织物的水接触角变化。可看出，涤纶织物经酶处理后，水接触角由93.4°降至83.1°，达到织物表面由疏水向亲水转化的改性。这是由于角质酶催化涤纶表面酯键水解，酯键的断裂会生成亲水的基团(羟基和羧基)，使得纤维表面极性增加，进而改善了涤纶织物的亲水性能。

图10 角质酶处理前后涤纶织物接触角变化Fig.10 Change of contact angle of polyester fabric before (a)and after (b) cutinase treatment

3 结 论

1)采用H.insolens角质酶对涤纶织物进行改性，优化工艺参数为：角质酶用量100 U/mL，反应时间72 h，pH值8.5，温度60 ℃。在此条件下，角质酶催化涤纶织物水解得到的反应产物高达120.85 mg/L，主要为对苯二甲酸(TPA)和单(对苯二甲酸-2-羟基乙酯)(MHET)。进一步在反应体系中加入表面活性剂Trition X-100，可使产物的释放量提高136%。

2)H.insolens角质酶处理后涤纶织物表面变得粗糙，经亚甲基蓝染色后，在550～650 nm波长下的K/S值增加显著。

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