离子色谱-脉冲安培法同时测定牛肉水解产物中6 种糖组分的含量

陈修红，冀 鹏，何国亮，夏 然，李祖明，刘 佳,

（1.国贸食品科学研究院有限公司，国家副食品质量监督检验中心，北京 102209；2.中粮营养健康研究院有限公司，营养健康与食品安全北京市重点实验室，北京 102209；3.北京联合大学生物化学工程学院，北京 100023）

牛肉富含蛋白质、氨基酸和多种矿物质，脂肪含量相对较低，是西方发达国家的主要消费肉食之一[1−2]，其价格远远高于鸡肉、鸭肉、猪肉等[3]。随着人们生活水平的提高以及饮食结构的改变，我国居民对牛肉的需求量也在日益攀升，对牛肉的品质指标和食品安全指标提出了更高要求。近年来，随着食品安全监管部门检测技术的不断完善和更新，食品掺假手段也在日益“进化”，不法商贩通过将食用胶与水混合注入待宰动物体内的方式来增重以谋取暴利[4]，这些食用胶是一类高分子植物多糖，含有大量的氢键，能与蛋白质结合形成巨大的网状结构，并易与水结合形成膜从而锁住水分阻止水分迁移[5−6]，这会导致按GB 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》第三法蒸馏法测定水分含量的结果偏低，达到牛肉水分含量指标表观合格的目标而躲过市场监管，导致市场上出现了“注水”牛肉的升级版“注胶”牛肉，严重损害消费者的利益并威胁民众的生命健康。

根据国家标准GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》，允许使用于食品的食用胶约有40 种，其中肉制品使用最为广泛的食用胶多为卡拉胶、瓜尔胶、黄原胶、魔芋胶等[7]。目前，畜禽肉中仅有卡拉胶一种食用胶的标准检测方法，BJS201804《畜肉中卡拉胶的测定》和NY/T 3876-2021《猪肉中卡拉胶的检测 液相色谱一串联质谱法》，无法实现食用胶注胶掺假的通用型检测。由于食用胶多为碳水化合物，由不同的单体（如葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖等）以β糖苷键、α糖苷键及二者混合的不同链接方式而成的多糖大分子[8−9]，通常可通过化学酸解或生物酶解为小分子糖进行测定[10−11]。目前检测食品中糖含量的方法主要有滴定法、高效液相色谱法、液质连用法、离子色谱法等[12−15]，滴定法操作步骤繁琐，前处理耗时较长；液相色谱法示差检测法灵敏度低，平衡时间长；液质联用仪设备昂贵，结果易受基质效应影响；离子色谱法测定糖具有样品前处理简单，无需衍生，且专一性强、灵敏度高的特点，应用于糖类的测定被广泛关注[13−14]。

本研究样品水提物经蛋白沉降后，利用化学酸解的方式水解为单糖，通过离子色谱-脉冲安培检测器，同时分离测定牛肉水解产物中阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、核糖等6 种糖组分。旨在建立一种操作简便、灵敏度高、分离度好，能够快速、准确地测定6 种糖组分方法，积累牛肉水解产物中6 种糖组分的本底数据，为实现“注胶牛肉”的掺假检测提供一种新的思路和方向。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛肉 北京市各大型农产品市场；瓜尔豆胶浙江一诺生物科技有限公司；阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、核糖 标准品，中国计量科学研究院；50%氢氧化钠溶液 德国Merck 公司；硫酸、无水乙醇 分析纯，国药集团；三氯乙酸 分析纯，阿拉丁试剂公司；广谱pH 试纸 NEWSTAR 新星；实验室用水是符合国家标准GB/T6682-2008 规定的一级水，使用前制备。

ICS-5000+离子色谱仪（脉冲安培检测器，Au 工作电极，Ag/AgCl 参比电极，Chromenleon6.80 SR15色谱工作站） 美国ThermoFisher 公司；GM2000 刀式研磨仪 德国Retsch 公司；HS4 磁力搅拌器 德国IKA 公司；Allegra 64R 高速冷冻离心机 美国贝克曼公司；SR-2DS 振荡器 日本TAITEC 公司；KQ-500DB 型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器；SWT-100 恒温水浴摇床 杭州米欧仪器；BPG-9070A 精密鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器；BSA 224-CW 天平（感量0.0001 g） 美国Sartorius 公司；Milli-Q 超纯水系统 德国Merck 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制 精密称取阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、核糖等标准品10 mg（精确至0.0001 g），加水溶解定容至10 mL，得浓度为1.0 mg/mL 的标准储备液。精密吸取适量，配制成葡萄糖浓度为10 μg/mL、其他单糖浓度为1 μg/mL 的混合标准溶液。混合标准溶液加水逐级稀释成标准系列工作液，获得葡萄糖浓度为0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 μg/mL，其他单糖浓度为0.025、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 μg/mL 的溶液，临用现配。

1.2.2 注胶牛肉制备 牛肉样品经刀式研磨仪捣碎，备用。本研究以瓜尔豆胶为例，自制注胶牛肉。精密称取0.5 g 瓜尔豆胶，加入1 mL 无水乙醇在磁力搅拌器上搅拌分散，在搅拌状态下倒入4 ℃冰箱预冷水10 mL，室温条件下100 r/min 充分搅拌2 h 以上制备瓜尔豆胶水溶液。精密称取样品5 g（精确至0.001 g）于50 mL 离心管中，加入2 mL 制备好的瓜尔豆胶水溶液，充分涡旋混匀模拟制备注胶牛肉样品。

1.2.3 样品前处理 精密称取测试样品5 g（精确至0.001 g）于50 mL 离心管中（注胶牛肉按 1.2.2 制备），加入质量浓度为1%三氯乙酸溶液至50 mL，振荡器震荡10 min，4 ℃条件下10000 r/min 离心5 min，转移上层溶液放入80 ℃水浴锅中加热5 min[16−18]继续沉淀，冰水迅速冷却，4 ℃条件下10000 r/min离心5 min，转移10.0 mL 上清液到20 mL 水解管中，加入浓度为4.0 mol/L 硫酸溶液1.8 mL，封盖摇匀，置于鼓风干燥箱中100 ℃加热水解2 h[19]，冷却至室温，转移至100 mL 比色管中，并用20 mL 超纯水清洗水解管合并至比色管，用少量4.0 mol/L 氢氧化钠调节pH 至6.0~8.0，加水定容，摇匀后移取2.0 mL至10 mL 容量瓶中，用水定容。过0.22 μm 水系滤膜，待测。

1.2.4 前处理条件优化 精密称取测试样品5 g（精确至0.001 g）于50 mL 离心管中，对蛋白质沉淀：沉淀剂（水和1%三氯乙酸溶液）、沉淀温度（60、80、90 ℃）；水解条件：水解时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）、水解酸度（1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mL 的4.0 mol/L 硫酸溶液）等进行单因素实验。

1.2.5 色谱条件 色谱柱：Dionex CarboPacTMPA20保护柱（3 mm×30 mm）、Dionex CarboPacTMPA20（3 mm×150 mm）；柱温：30 ℃；流速：0.5 mL/min；进样量：10 μL；流动相：淋洗液A（0.2 mol/L 氢氧化钠溶液），淋洗液B（5 mmol/L 氢氧化钠溶液）；洗脱程序：−30~0 min 淋洗液A（色谱柱再生）；0~20 min 淋洗液B（等度洗脱）；检测器：脉冲安培PAD 检测器（Au 工作电极，Ag/AgCl 参比电极），检测器温度30 ℃，检测器四电位波形见表1；采集时间：20 min。对标准溶液和样品溶液按以上色谱条件进样分析，依据保留时间定性，采用外标法定量。

表1 糖测定的积分安培检测波形Table 1 Integrated pulsed amperometric detection waveforms for sugars

1.3 数据处理

采用Thermo Chromenleon 6.80 SR15 色谱工作站进行数据采集，并利用Excel 进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

食品基质复杂，杂质不仅会对目标峰产生干扰，还容易对进样针、色谱柱及检测器等造成不良影响[7]，在样品前处理过程中对沉淀蛋白质的方法进行了优化，同时还考察了不同的酸度、时间等水解条件。

2.1.1 蛋白质沉淀 常见的除蛋白的方法有金属复合盐法[15]、有机试剂法[20−21]、pH 沉淀法[22−23]、加热变性法[24]等。本研究样品前处理过程分别考察了将超纯水和1%三氯乙酸作为提取溶剂时的溶液澄清度，发现1%三氯乙酸能通过降低提取液pH 而使蛋白质变性提高澄清度；在此基础上考察了60、80、90 ℃等不同温度下的蛋白质沉淀情况，结果表明，80 ℃条件下提取液基本能达到澄清透明状态。因此，确定1%三氯乙酸溶液作为蛋白沉淀剂并辅助80 ℃加热沉淀效果较好满足离子色谱分析测试要求，如图1 所示。

图1 蛋白沉淀效果图Fig.1 Efficacy of protein precipitation注：1：水提物；2：1%三氯乙酸提取物；3：1%三氯乙酸提取物在80 ℃加热沉淀，双平行。

2.1.2 水解条件 为了考察不同条件对样品中多糖水解能力的影响，本文以样品中添加一定量的瓜尔豆胶为考察物，选取瓜尔豆胶的分子组分半乳糖和甘露糖以及牛肉糖原的分子组分葡萄糖含量为目标结果，优化了水解酸度、水解时间等条件，结果如图2 所示。

图2 不同水解时间和加酸体积对糖含量的影响Fig.2 Effects of different hydrolysis time and acid volume on sugar contents

由图2 可以看出，随着时间的增长，半乳糖、甘露糖、葡萄糖含量先升高后降低，水解2.0 h 时三种单糖含量最高，为最佳水解时间；水解时间低于2.0 h，多糖分子水解不完全，导致单糖含量较低；水解时间超过2.0 h，高温液态水中单糖易发生脱水反应，生产糠醛或其衍生物[25−26]。随着酸用量的增加，半乳糖、甘露糖、葡萄糖含量先升高后降低，酸用量为1.8 mL即水解酸度[H+]为1.2 mol/L 时三种单糖含量最高，为最佳水解酸度，继续增加酸用量单糖会在高温和酸性条件下会显现糠醛副反应，即单糖开始转化为羟甲基糠醛[27−28]，三种单糖浓度开始下降。因此，本实验选择最佳的水解条件为1.8 mL，100 ℃加热时间为2 h。

2.2 色谱条件优化

糖类物质一般为弱酸性，其pKa 值约在12~14 之间。在碱性溶液中其存在形式为阴离子状态，可选用氢氧化钠淋洗液洗脱，通过阴离子交换色谱柱实现分离[29−31]。试验用葡萄糖浓度为10 μg/mL、其他单糖浓度为1 μg/mL 的混合标准溶液考察了用CarboPacTMPA20 色谱柱不同的淋洗液浓度、流速、柱温等色谱条件。

2.2.1 淋洗液浓度的筛选 本研究对比了在10、5、3 mmol/L 等三种不同浓度氢氧化钠溶液作为淋洗液B 对色谱分离情况的影响，平行进样三次，如图3所示。实验表明，淋洗液的氢氧化钠溶液浓度的高低对分离效果和分离时间有直接影响，过高浓度10 mmol/L 淋洗液色谱出峰过快导致半乳糖和葡萄糖无法完全分离，如图3a 所示；过低浓度3 mmol/L淋洗液色谱峰能给完全分离，但会增加色谱峰保留时间甚至发生保留时间漂移，如图3c 所示。综合以上因素，选取分离度较好和出峰时间适宜的5 mmol/L氢氧化钠作为淋洗液B 进行洗脱，色谱图见图3b。

图3 不同淋洗液浓度下的色谱图Fig.3 Chromatograms at different eluent concentrations注：1：阿拉伯糖；2：半乳糖；3：葡萄糖；4：甘露糖；5：果糖；6：核糖；图4~图6 同；a：10 mmol/L 淋洗液；b：5 mmol/L 淋洗液；c：3 mmol/L 淋洗液。

2.2.2 流速的筛选 本研究考察了在0.2、0.5、0.8 mL/min 等三种不同流速对色谱分离情况的影响，如图4 所示。实验表明，随着流速的提高，出峰时间提前，色谱峰型变窄响应值增大；当流速设为0.2 mL/min 时，如图4a 所示，出峰较慢、色谱峰展宽、响应值低，采集时间需要延长为40 min；当流速提升至0.8 mL/min 时，如图4b 所示，系统压力有明显提高，基线不平稳波动较大；当流速设为0.5 mL/min时，如图4c 所示，色谱峰分离度良好。选取0.5 mL/min流速进行测定。

图4 不同流速下的色谱图Fig.4 Chromatograms at different eluent flows注：a：0.2 mL/min 流速；b：0.8 mL/min 流速；c：0.5 mL/min 流速。

2.2.3 柱温的筛选 本研究对比考察了25、30 和35 ℃三个不同的柱温对色谱分离度和灵敏度方面的差异，如图5 所示。结果表明，随着柱温的升高，出峰时间提前，响应值增大。当柱温为25 ℃时，如图5a 所示，出峰较慢、色谱峰展宽、响应值低，采集时间需要延长；增加柱温至35 ℃，如图5c 所示，虽然目标物灵敏度无明显变化，果糖和核糖分离度比柱温为30 ℃（如图5b 所示）稍差，考虑到色谱柱的使用温度越低使用寿命越长这个因素，最终选择测定柱温为30 ℃。

图5 不同柱温下的色谱图Fig.5 Chromatograms at different column temperatures注：a：25 ℃柱温；b：30 ℃柱温；c：35 ℃柱温。

综上，在30 ℃柱温条件下，以0.5 mL/min 流速用5 mmol/L 氢氧化钠作为淋洗液B 进行洗脱能够实现6 种糖较好地分离，色谱图如图6 所示。

图6 混合糖标准溶液色谱图Fig.6 Chromatogram of mixed sugar standards

2.3 方法学考察实验

2.3.1 标准曲线与检出限 将系列标准工作液按优化色谱条件进样分析，分别以浓度和峰面积为横、纵坐标绘制标准曲线，并计算线性回归方程和相关系数。对标准溶液进行逐级稀释，以信噪比S/N 等于3 时的溶液浓度为检出限。结果表明，葡萄糖在0.25~2.50 μg/mL；阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖在0.025~0.25 μg/mL 范围内线性关系良好，各中糖组分线性范围、回归方程、相关系数r、检出限等见表2。

表2 6 种化合物的线性范围、回归方程、检出限（S/N=3）、定量限（S/N=10）Table 2 Linear ranges, regression equations, LODs (S/N=3) and LOQs (S/N=10) of the six compounds

2.3.2 方法重复性 取牛肉样品6 份，按 1.2.3 样品前处理方法进行操作，在优化的色谱条件下上机进样分析测试，计算样品中6 种糖组分含量和相对标准偏差，结果见表3。结果表明，相对标准偏差RSD 介于2.3%~5.5%，该方法重复性良好。

表3 重复性测定结果（n=6）Table 3 Repeatability test results (n=6)

2.3.3 方法加标回收率 牛肉样品12 份，均分成4 组，每组3 个平行样。其中，1 组为本底测定，另外3 组按低、中、高三个浓度水平加入混合标准品溶液，按方法要求操作并测定，分别计算6 种糖组分的回收率，测定结果见表4。结果显示，6 种糖组分的回收率良好，范围在79.6%~116.5%之间，具有较高的准确度。

表4 加标回收率测定结果（n=3）Table 4 Recovery test results (n=3)

2.3.4 市售样品检测 为了验证方法的适用性，本次实验选取市售30 份牛肉样品对其以已建立的方法对阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、核糖6 种糖组分含量进行测定，结果见表5。测定结果显示，本次实验收集的市售牛肉均检出半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、核糖等，这与早年英国科学家梅西等人验证的牛肉中存在葡萄糖、果糖、甘露糖和核糖等结论基本一致[32−35]，并未检出阿拉伯糖。同时，往其中一份牛肉样品中添加少量（约0.2%）的瓜尔豆胶，对其按已建立的方法进行糖组分含量的测定，发现半乳糖、甘露糖的含量明显提高，其中，甘露糖占总糖占比由0.05 提高至0.25，明显高于另外29 份市售牛肉样本的0.03~0.19。这是由于样品中添加的瓜尔豆胶是一种半乳甘露聚糖[36]，分子由半乳糖和甘露糖（1:2）组成，经前处理水解后势必增加瓜尔豆胶特征单糖甘露糖的占比。仅1 份市售样本的甘露糖占总糖占比为0.24，与添加的瓜尔豆胶的阳性样本基本一致。由此表明，可以通过添加不同类型的食用胶（卡拉胶、黄原胶、瓜尔胶、魔芋胶等）至牛肉样品中，通过本研究所建立的检测方法，积累获得各种食用胶的特征单糖甘露糖占比，为实现“注胶牛肉”的掺假检测提供了一定的可行性。

表5 市售牛肉样品6 种糖组分测定结果Table 5 Determination results of six sugars in commercial beef samples

续表 5

3 结论

本文建立了离子色谱-脉冲安培检测方法同时测定牛肉水解产物中阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、核糖6 种糖组分的含量，并对样品的前处理及色谱条件进行了考察和优化，使其可用于市售样品的检测。结果表明，6 种糖在本方法条件下能够完全分离，葡萄糖在0.25~2.50 μg/mL、其他5 种糖在0.025~0.25 μg/mL 之间线性关系良好，精密度RSD在2.3%~5.5%，回收率在79.6%~116.5%之间。该方法便于操作、灵敏度高、分离度好，能够准确、快速地测定牛肉水解产物中糖组分含量，为实现注胶肉的检测提供一种新的思路和方向。