植物乳杆菌-Gm4 发酵制备酸面团粉的工艺优化

张国华，贺霞霞，卫晓蓉，赵明利，张越洋

（山西大学生命科学学院，山西太原 030006）

酸面团（Sourdough）是以谷物加工产物、水为主要原料，接种微生物，经培养、发酵等工艺制成的产品[1]，其作为世界范围内的传统发酵剂具有悠久的历史[2]，在欧洲不同的国家被分别称为“Sourdough”、Lievitonaturale（意大利）、Levain（法国）、Sauerteig（德国）、Masa madre（西班牙）等，主要用于培烤食品。在我国，一般被称为老面、酵子、面肥等，主要用作面食发酵。

酸面团是一种多菌种复合发酵剂，具有改善发酵面制品的风味[3]、延长货架期[4]、延缓老化[5]、提高面制品的营养价值[6−9]等作用，主要分为三种类型：自然发酵型酸面团、接种发酵型酸面团和混合型酸面团[10]。李晓敏等[11]利用高通量测序技术分析发现酸面团中的优势菌群有乳杆菌属、乳球菌属、魏斯氏菌属及酵母属等。MICHEL 等[12]的研究也得出相似结论，酸面团中的优势菌种以乳酸菌和酵母菌为主[13]，HAMMESW 等[14]的研究证明植物乳杆菌是酸面团中典型的发酵菌种。不同的菌种在面团发酵过程中所起到的作用不同[15]，植物乳杆菌能优化面团的流变学性质[16−17]、提高面团的拉伸性能[18−19]、增加面团的烘焙体积[20]及延长面制品的货架期[21]。植物乳杆菌利用糖类和蛋白质，产生某些风味物质的重要前体[22−23]，如小肽、游离氨基酸等，以及丰富的有机酸[24]，作为酸味剂赋予食品独特风味[25]。此外，廖兰等[26]的研究表明植物乳杆菌B02012 可以改变酸面团小麦的蛋白结构，并可应用于低敏发酵谷物制品的加工中。

国外相关研究表明在酸面团中接种乳酸菌进行发酵可延长其保质期，使酸面团易于储存和运输，已被广泛应用于面包工业中[27]。相比之下，国内传统酸面团的生产以家庭或小作坊自制为主[28]，由于缺少酸面团的相关产品标准，目前尚未有工业化生产的酸面团产品[29]。因此，实现优良菌种和新型发酵改良剂的工业化生产，对推进我国传统发酵面食改良剂的工业化进程具有重要的现实意义[30]。

本研究以实验室保藏的植物乳杆菌-Gm4（Lactobacillus plantarum-Gm4, LP-Gm4）为研究对象，在单因素实验基础上进行响应面试验，优化植物乳杆菌发酵酸面团粉（简称酸粉）制备工艺，以期为开发适应工业化生产的发酵面食改良剂提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

LP-Gm4 保藏于山西大学生命科学学院；mMRS培养基：麦芽糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉浸粉10 g、酵母粉5 g、乙酸钠5 g、柠檬酸三铵2 g、磷酸氢二钾2 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g、吐温80 1 mL、蒸馏水1000 mL、pH（5.4±0.1）；五得利金特精高筋小麦粉 五得利面粉集团；燕牌高活性干酵母 乐斯福管理（上海）有限公司。

LY01-3 厌氧培养箱 上海龙跃仪器设备有限公司；CF340C 卡士发酵箱 中山卡士电器有限公司；HMJ-A35A1 小熊和面机 佛山市小熊厨房电器有限公司；JYS-A800 绞肉机 九阳股份有限公司；DHG-9240A 电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；SC-3614 低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；雷磁pHS-3C pH 计 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 LP-Gm4 菌株活化 挑取斜面保藏的LP-Gm4，接种至10 mL 无菌mMRS 液体培养基中，将其于32 ℃厌氧培养活化24 h。按1%的接种量接种于无菌mMRS 液体培养基中，厌氧培养得到LP-Gm4 发酵液，4500 r/min 离心5 min 收集沉淀得LP-Gm4 菌。

1.2.2 LP-Gm4 酸面团的制作 用无菌蒸馏水清洗LP-Gm4 菌两次得菌悬液。将小麦粉、LP-Gm4 菌悬液和无菌蒸馏水按比例加入和面机中，和面10 min，保证面团得率[31]（D（%）=100×（面粉质量+水质量）/面粉质量）为150%。手工揉制3~5 min 保证面团呈表面光滑，置于发酵箱，在相对湿度80%、选定的时间和温度条件下发酵。

1.2.3 LP-Gm4 酸面团制备工艺的单因素实验 以LP-Gm4 酸面团的pH 和总可滴定酸度（total titratable acidity，TTA）值为指标，设定LP-Gm4 添加量为9 lg（CFU/g）小麦粉、发酵时间为12 h，探究发酵温度（20、25、30、35、40 ℃）对LP-Gm4 酸面团品质的影响；设定LP-Gm4 添加量为9 lg（CFU/g）小麦粉、发酵温度为30 ℃，探究发酵时间（8、12、16、20、24 h）对LP-Gm4 酸面团品质的影响；设定发酵时间为12 h，发酵温度为30℃，探究LP-Gm4 添加量（6、7、8、9、10 lg（CFU/g）小麦粉）对LP-Gm4 酸面团品质的影响。

1.2.4 LP-Gm4 酸面团制备工艺的响应面优化试验

根据单因素实验结果，按Box-Behnken 中心组合试验设计原理，选择发酵温度（A）、发酵时间（B）和LP-Gm4 添加量（C）为自变量，以LP-Gm4 酸面团的TTA 值（R）为响应值进行响应面优化试验，试验因素水平如表1 所示。

表1 响应面实试验因素水平设计Table 1 Response surface test factor and level design

1.2.5 LP-Gm4 发酵酸粉制备方法 采用响应面试验优化后的工艺参数制备LP-Gm4 酸面团，将其揉搓成小块后置于篦上，放置到电热恒温鼓风干燥箱中35 ℃干燥6 h，再绞肉机碎制成LP-Gm4 发酵酸粉过40 目筛。

1.2.6 LP-Gm4 发酵酸粉馒头的制作方法 LP-Gm4发酵酸粉馒头的制作配方见表2，参考陈友磊等[32]的方法，将小麦粉、LP-Gm4 发酵酸粉、高活性干酵母、水按配方加入和面机搅拌10 min，手工揉制3~5 min 至面团表面光滑完整，将馒头坯置于相对湿度80%、发酵温度35 ℃的醒发箱中醒发40 min，随后汽蒸25 min 即得馒头样品，样品于室温冷却后装袋密封。

表2 LP-Gm4 发酵酸粉馒头配方Table 2 Formula of LP-Gm4 sourdough powder steamed bread

1.2.7 指标测定

1.2.7.1 LP-Gm4 活菌数的测定 参考GB 4789.35-2016 食品微生物学乳酸菌检验的操作步骤，在无菌环境下取1 mL LP-Gm4 培养液于装有9 mL 灭菌蒸馏水的试管中，梯度稀释至10−9浓度，选取3 个适宜浓度的稀释液，各吸取100 μL 分别涂布至mMRS固体培养皿上，将培养基于35 ℃厌氧条件下培养48 h 后计菌落数，每个梯度做3 个平行。

1.2.7.2 LP-Gm4 酸面团的酸度测定 参考ZHANG等[33]的方法，测定pH 和TTA。准确称取10.0 g LP-Gm4 酸面团样品，加入少量无二氧化碳水，用磁力搅拌器中速搅拌10 min 后用无二氧化碳水转移至100 mL 容量瓶中定容至100 mL。以pH 计测定所得样液即LP-Gm4 酸面团pH，每份样品平行测定3 次。

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以0.1 mol/L 的NaOH 标准溶液将上述样液滴定至pH 为8.2，记消耗标准溶液体积的数值为V1，用无菌水代替试液进行空白实验，重复上述操作，记空白试液消耗标准溶液体积的数值为V2。样品中TTA 用乳酸质量分数X 表示，数值以克每千克（g/kg）表示。根据以下公式计算TTA 值，计算结果保留一位小数，每份样品平行测定3 次。

1.2.7.3 LP-Gm4 发酵酸粉理化及微生物指标的测定

在无菌环境中称取25 g LP-Gm4 发酵酸粉置于灭菌锥形瓶中，加入225 mL 蒸馏水并用磁力搅拌器搅拌10 min。最后参照 1.2.7.1 进行稀释涂布并计菌数，并参照GB 5009.3-2016 食品中水分的测定中的直接干燥法测定LP-Gm4 发酵酸粉中的水分含量，参照 1.2.7.2 测定pH 和TTA 值。

1.2.7.4 LP-Gm4 发酵酸粉馒头的感官评价 参考张国华等[34]的感官评定方法，遴选6 名（男女各半）食品专业的成员组成评定小组，对LP-Gm4 发酵酸粉馒头进行感官评价，满分为100 分，实验三次重复后取均值。LP-Gm4 发酵酸粉馒头的感官评分标准见表3。

表3 LP-Gm4 发酵酸粉馒头感官评分标准Table 3 Sensory scoring criteria of LP-Gm4 sourdough powder steamed bread

1.3 数据处理

利用Excel 2019 及Origin 2021 进行数据分析和图表绘制，采用Design Expert 8.0.6 进行响应面分析，数据显著性分析利用ANOVA 进行，P＜0.05 判断差异显著，P＜0.01 判断差异极显著。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 发酵温度对LP-Gm4 酸面团pH 和TTA 值的影响 在LP-Gm4 添加量为9 lg（CFU/g）小麦粉、发酵时间为12 h 的条件下，不同发酵温度对LP-Gm4酸面团pH 和TTA 值的影响见图1。随着温度的升高，LP-Gm4 酸面团的pH 先迅速降低，到达最低值3.65 后缓缓升高；TTA 值则先迅速升高，达到最高值9.3 后缓慢降低。二者的拐点都出现在发酵温度为30 ℃时，可能是由于植物乳杆菌的最适温度在30 ℃[35]，发酵温度较低时LP-Gm4 活动受到抑制，生长缓慢，面团发酵不充分，产酸量不足；当发酵温度到达适宜温度时，LP-Gm4 生长旺盛，利用糖类和蛋白质发酵大量产酸；而随着发酵温度的持续升高，LPGm4 的活性降低。因此，选择28~32 ℃的温度范围进行响应面试验设计。

图1 发酵温度对 LP-Gm4 酸面团 pH 和 TTA 值的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on pH and TTA value of LP-GM4 sourdough

2.1.2 发酵时间对LP-Gm4 酸面团pH 和TTA 值的影响 在LP-Gm4 添加量为9 lg（CFU/g）小麦粉、发酵温度为30 ℃的条件下，发酵时间对LP-Gm4 酸面团pH 和TTA 值的影响，见图2。随着发酵时间的延长，LP-Gm4 酸面团的pH 有递减趋势，TTA 值呈现递增趋势。在发酵8~12 h 时，LP-Gm4 产酸速度最快；随后LP-Gm4 酸面团的pH 缓慢降低，TTA 值略有升高。这可能是由于随着时间的延长，有机酸等代谢产物逐渐积累，LP-Gm4 自身的生长受到抑制。因此，结合曲线变化趋势，考虑经济性，选择发酵时间在10~14 h 范围内，每间隔2 h 选择实验点进行后续响应面试验设计。

图2 发酵时间对 LP-Gm4 酸面团 pH 和 TTA 值的影响Fig.2 Effect of fermentation time on pH and TTA value of LP-GM4 sourdough

图3 LP-Gm4 添加量对 LP-Gm4 酸面团 pH 和 TTA 值的影响Fig.3 Effect of LP-Gm4 added amount of bacteria on pH and TTA value of LP-Gm4 sourdough

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验结果及分析 在三组单因素实验确定的数据基础上，按照Box-Behnken 原理选择发酵温度（A）、发酵时间（B）和LP-Gm4 添加量（C）作为自变量，以LP-Gm4 酸面团的TTA 值（R）为响应值，设计三因素三水平的优化试验共17 个。响应面数据结果见表4。

表4 响应面试验设计及结果Table 4 Response surface experimental design and results

通过对表4 实验结果进行多元回归拟合分析，得到以LP-Gm4 酸面团的TTA 值为响应值的拟合方程 Y=10.10+0.16A+0.90B+5.86C+0.55AB+1.48 AC+0.50BC+0.01A2−0.86B2+1.71C2。对模型进行显著性检验，结果见表5。模型方差分析表明，该模型P＜0.0001，模型极显著；失拟项P值>0.05，失拟项不显著，表明该方程拟合程度较好。模型总决定系数R2=0.9780，校正决定系数=0.9497，说明此模型可以解释94.97%的响应值变化，自变量选择合适，可用来预测LP-Gm4 酸面团的TTA 值，具有较高的可信度和可行性。

表5 Box-Behnken 二次回归模型方差分析Table 5 Analysis of variance of Box-Behnken quadratic regression model

由F值检验可获得影响LP-Gm4 酸面团TTA值的主次因素为：LP-Gm4 添加量（C）>发酵时间（B）>发酵温度（A）。其中，一次项B、C，二次项C²和交互项AC 对LP-Gm4 酸面团的TTA 值影响显著（P＜0.05），而一次项A，二次项A²、B²和交互项AB、BC 对响应值的影响不显著（P>0.05）。由此可知，各实验因素对LP-Gm4酸面团的TTA 值的影响比较复杂，不是简单的线性关系。

2.2.2 响应面交互作用分析 使用Design Expert 8.0.6 软件对发酵时间、发酵温度和LP-Gm4 添加量三因素及其之间的交互作用进行分析得到相应的响应面。交互作用的显著性可以由等高线的形状呈现出来，即趋于椭圆交互作用强，趋于圆形则相反[37]。由图4 可知，发酵温度（A）与LP-Gm4 添加量（C）之间的交互作用对LP-Gm4 酸面团TTA 值的影响最大（图4-c），发酵时间（B）和LP-Gm4 添加量（C）之间的交互作用对LP-Gm4 酸面团TTA 值的影响最小（图4-b）。在适当的发酵时间和温度下，添加较高比例的LP-Gm4，面团TTA 值增长较快，这与单因素实验结果一致。

图4 各因素之间的交互作用对 LP-Gm4 酸面团 TTA 值的影响Fig.4 Influence of interaction of various factors on TTA value of LP-GM4 sourdough

2.2.3 响应面优化结果验证 如前所述，有机酸过多的积累会抑制菌株的生长、降低面团的品质，而且酸涩的口感导致发酵终产品不被消费者接受，故以TTA=20 为目标值，根据回归模型预测植物乳杆菌发酵面团的最佳发酵工艺参数为：发酵温度31.76 ℃、发酵时间13.44 h、LP-Gm4 添加量10 lg（CFU/g）小麦粉，预测LP-Gm4 酸面团TTA 值为20。考虑实际操作的简便性，将各参数修正为发酵温度31.8 ℃、发酵时间13.5 h、LP-Gm4 添加量10 lg（CFU/g）小麦粉，在此优化条件下进行3 次重复性验证实验，实际测得LP-Gm4 酸面团TTA 值的平均值为20.1，与预测值之间没有显著性差异，说明实验结果与模型拟合良好，通过响应面法优化得到的最佳工艺参数可靠性高。

2.2.4 LP-Gm4 发酵酸粉理化及微生物指标测定经工艺优化后制得的LP-Gm4 发酵酸粉微酸且带有小麦香气，在自然光下呈现淡黄色，其理化及微生物指标如表6 所示。

表6 LP-Gm4 发酵酸粉理化及微生物指标Table 6 Physicochemical and microbial indices of LP-Gm4sourdough powder

2.2.5 馒头感官评定分析 使用优化参数制备的LP-Gm4 发酵酸粉制作馒头，经评定小组品评打分后绘得感官评定雷达图（图5）。在4 组实验样品中，添加了LP-Gm4 发酵酸粉的馒头感官评分优于未添加LP-Gm4 发酵酸粉的干酵母馒头。且当LP-Gm4发酵酸粉添加量为1:8（实验组2）时，馒头的感官评分最高。由图5 可直观看出LP-Gm4 发酵酸粉馒头在表皮结构、内部弹性、口感、滋味和气味上明显优于干酵母馒头，而在表皮色泽和内部组织上与干酵母馒头差异不明显。

图5 LP-Gm4 发酵酸粉馒头感官评分雷达图Fig.5 Sensory score radar map of LP-GM4 sourdough powder steamed bread

3 结论

通过单因素实验及响应面试验确定影响LP-Gm4酸面团TTA 值的主次因素为：LP-Gm4 添加量>发酵时间>发酵温度。最佳工艺参数为：发酵时间13.5 h、发酵温度31.8 ℃、LP-Gm4 添加量10 lg（CFU/g）小麦粉。此条件下制得的LP-Gm4 发酵酸粉具备较好的理化特性，其pH 为3.51，TTA 值为17.8，LP-Gm4菌数为7.2×108CFU/g。当LP-Gm4 发酵酸粉添加量为1:8 时，馒头的感官评分高达89.9，相比干酵母馒头具有更光滑完整的表皮结构、更细腻均匀的内部结构、更浓郁的麦香味和老面馒头独有的发酵香味。