PKM2促进肿瘤发展的作用机制研究

王彩虹， 陈剑飞， 鞠久君， 朱雪洁， 王彩霞*

1.首都医科大学附属北京友谊医院，北京热带医学研究所，北京100050；2.滨州医学院中西医结合学院，烟台市肿瘤代谢中药药理重点实验室，山东 烟台264003

肿瘤作为世界上发病率和死亡率都较高的疾病，已成为世界性的公共卫生问题。肺癌是最常见的肿瘤，也是最致命的肿瘤。根据全球最新的癌症统计数据，肺癌的发病率和死亡率均排在第一位［1］。乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、胃癌和肝癌都有较高的新发病率。前列腺癌和结直肠癌在男性中的发病率较高，而肝癌和胃癌死亡率较高。对于女性来说，乳腺癌是最常见的肿瘤且死亡率较高。因此，癌症的预防和治疗是研究者需要面对和解决的重大问题。

丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）在调节细胞代谢方面起着关键作用。作为一种进化上保守的代谢酶，丙酮酸激酶可促进磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）之间的不可逆磷酸反应，从而产生磷酸酯和三磷酸腺苷（adenosine trisphosphate，ATP）。在哺乳动物中，存在4 种组织特异性的丙酮酸激酶，分别是PKL、PKR、PKM1 和PKM2［2］。其 中PKM1 和PKM2 是 由PKM基 因 通过可变剪接形成的。PKM2 作为其中一种亚型，主要存在于具有高合成代谢要求的高增殖细胞中［3］，尤其是肿瘤和胚胎组织中。此外，目前已发现PKM2 在肺癌［4］、乳腺癌［5］等肿瘤组织中过表达，并作为癌细胞代谢的关键调节剂［6］。除此之外，PKM2 还可以充当转录共激活剂，促进癌细胞中的基因转录。

PKM2 的过表达在人类癌症中被普遍发现，并与不良的临床结果相关［3，7］。已有研究报道，PKM2可以调节多发性骨髓瘤中NEK2的表达，表明它可以作为预后标记［8］。在多发性骨髓瘤患者中，预后不佳与PKM2基因表达水平较高相关［9］。高肿瘤细胞代谢活性和增殖能力由PKM2 反射，因此它可作为非有机分子标记［3］。此外，一些PKM2 也通过癌细胞坏死和肿瘤细胞更新释放到邻近组织，有望用于癌症的早期诊断。患者血液循环中的PKM2 水平可作为各种癌症［10］的潜在诊断标记。PKM2 在许多方面影响癌细胞的代谢活动。因此，PKM2 可以作为癌症治疗的靶标。一些研究表明，当shRNA 和miRNA 干扰PKM2 的表达时，这两种情况都会导致癌细胞死亡、代谢活性降低和肿瘤减少［11-12］。其他几项研究表明，当shRNA 干扰PKM2 表达时，肿瘤细胞对某些药物（如多克他塞尔和顺铂）的敏感性增加，从而促进肿瘤组织死亡和肿瘤的减少［13-14］。然而，PKM2能否成为广谱的肿瘤标志物及其对肿瘤影响的机制尚不清楚。

本研究旨在对PKM2 在不同瘤种的肿瘤组织和正常组织的表达量进行分析，探索其与肿瘤预后的关系，并检测其对肿瘤细胞增殖和迁移能力的影响。同时通过Hsp90α 的分泌和EMT 相关蛋白表达水平的检测，探索PKM2 调控肿瘤的分子机制，以期为肿瘤治疗提供新的诊断标志物和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及主要试剂

人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549、小鼠黑色素瘤细胞F0 和F10 均购自国家生物医学实验细胞资源库。所有细胞均用RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640 或 者DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养，其中加入10%的胎牛血清、100 U·mL−1的青霉素和100 μg·mL−1的链霉素。细胞在37 ℃含有5%CO2的恒温细胞箱中培养。其中RPMI-1640和DMEM购自中国维森特公司，胎牛血清购自美国GIBCO公司。

PKM2 抗体、E-cadherin 抗体、N-cadherin 抗体以及Vimentin 抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；Hsp90α抗体购自Abcam公司；βactin 抗体以及HRP 偶联抗兔和抗小鼠IgG 均购自中国中杉金桥公司；免疫印迹化学发光液购自Santa cruz 公司；PVDF 膜以及Transwell 小室购自Millipore 公司；Trans1-T1 感受态细胞购自北京全式金生物公司；细胞增殖检测试剂盒CCK8（Cell Counting Kit-8）购自Dojindo 公司；Turbo 转染试剂购自美国Invitrogen 公司；PCR 引物合成和测序在睿博生物有限公司完成。

1.2 TCGA数据库分析

通过GEPIA网站（http：//gepia.cancer-pku.cn/）对TCGA 数据库中33 种肿瘤（表1）患者肿瘤组织和正常组织PKM2 的mRNA 水平进行分析，并分析该基因的表达水平与癌症患者预后的总体生存率的关系。

表1 TCGA数据库中肿瘤中英文名称及缩写Table 1 The name and abbreviation of tumor in TCGA database

1.3 慢病毒质粒的构建及细胞转染

通过慢病毒感染的方法构建PKM2 敲低A549 细胞系。将包装质粒psPAX2、pVSVG 和转移质粒pLKO.1 共同转染到HEK-293T 细胞中，shRNA 序列为5'-CCGGGTTCGGAGGTTTGATGA AATCCTCGAGGATTTCATCAAACCTCCGAACTTTT TTG-3'。72 h后，收集病毒，用0.45 μm滤膜过滤，加入到A549细胞中。用新鲜培养基培养细胞48 h后，向细胞中加入嘌呤霉素进行筛选。将pkm2构建到pcDNA3.1 载体中。当细胞密度达到80%时，用turbo 试剂进行转染。以pcDNA3.1 空质粒作为对照。

1.4 免疫印迹

将不同处理组的细胞收集后，加蛋白上样缓冲液裂解并沸水浴煮10 min，进行SDS-PAGE 分离，转移到PVDF 膜，牛奶室温封闭后，加一定比例稀释的一抗室温孵育2 h，洗膜后，加入对应的二抗室温孵育1 h，洗膜后，加入化学发光液进行显影。

1.5 细胞增殖实验

收集对照组和过表达PKM2 的细胞后，种植等量的细胞到96孔板中，每组8个重复，细胞生长48 h后，弃上清，加入稀释好的CCK8溶液，37 ℃培养2 h后，450 nm吸光度下测定细胞生长情况。

1.6 Transwell 实验

将细胞收集后，进行计数，按照每孔200 μL约5×104个的细胞进行稀释。在24 孔板的下层加入600 μL 的培养基，上层放置Transwell 小室，每个小室中加入200 μL 稀释好的细胞悬液。每组进行3 个重复。37 ℃培养18 h 后，取出24 孔板，将细胞用4%的多聚甲醛固定。之后结晶紫染色，将小室上方的细胞用棉签擦去，显微镜下观察迁移的细胞，并进行计数。

1.7 统计学方法

本研究中的数据采用平均值±标准偏差（xˉ±SD），所有的免疫印迹、细胞增殖和迁移实验均进行至少3次重复。不同组别的比较通过GraphPad软件的非配对t检验完成。使用Kaplan-Meier 方法构建生存曲线，通过Log-rank（Mantel-Cox）检验不同组之间的差异。P＜0.05 被认为具有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 PKM2 在肿瘤组织和正常组织中的表达情况

根据TCGA 数据库分析不同瘤种中PKM2 在肿瘤组织和癌旁正常组织的表达量发现，在乳腺浸润癌、宫颈鳞癌和腺癌、结肠癌、弥漫性大B 细胞淋巴瘤、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、肝细胞肝癌、肺鳞癌、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺癌、直肠腺癌、皮肤黑色素瘤、胃癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤等15 种肿瘤中，PKM2 的mRNA 表达量明显高于正常组织（图1A，P＜0.05）。

此外，本研究利用免疫印迹的方法检测了PKM2 在不同恶性程度黑色素瘤细胞F0 和F10 中的表达，结果发现，PKM2 在恶性程度高的F10 细胞中表达量显著高于恶性程度低的F0 细胞（图1B）。

图1 PKM2在不同肿瘤中的表达情况Fig.1 The expression of PKM2 in different tumors

2.2 PKM2对癌症患者生存的影响

为了明确PKM2 对不同肿瘤患者生存的影响，本研究利用TCGA 数据集中的不同肿瘤数据集进行生存分析。分析结果显示，PKM 的表达水平在宫颈鳞癌和腺癌、头颈鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、急性髓细胞样白血病、肝细胞肝癌、肺腺癌、间皮瘤、胰腺癌、葡萄膜黑色素瘤等肿瘤中对生存时间有显著影响（图2），总体上，高表达PKM2 使得肿瘤患者的生存时间缩短。

图2 PKM2的表达与不同肿瘤患者预后的关系Fig.2 The relationship of expression of PKM2 and the prognosis of different tumor patients

2.3 过表达PKM2 对肺癌细胞增殖和迁移能力的影响

为了证明PKM2 对肿瘤细胞增殖和迁移能力的影响，本研究在A549 细胞中过表达PKM2（图3A），利用CCK8 检测过表达PKM2 对A549 细胞增殖能力的影响。结果发现，过表达PKM2 能够显著增加A549的增殖能力（图3B）。利用Transwell 检测PKM2 对肺癌细胞迁移能力的影响，结果发现，过表达PKM2 能够显著增强A549 细胞的迁移能力（图3C~D）。

图3 过表达PKM2对肺癌细胞增殖和迁移的影响Fig.3 The effect of PKM2 overexpression on the proliferation and migration of lung cancer cells

2.4 PKM2对Hsp90α分泌的影响

利用免疫印迹检测PKM2 对Hsp90α 分泌的影响，结果发现在乳腺癌MCF-7以及肺癌A549中过表达PKM2 后，胞内的Hsp90α 无明显变化，然而胞外Hsp90α 显著上调（图4）。这些结果表明，PKM2 能够促进乳腺癌和肺癌中的Hsp90α 的分泌。

图4 过表达PKM2对Hsp90α分泌的影响Fig.4 The effect of PKM2 overexpression on the secretion of Hsp90α

2.5 PKM2对EMT相关蛋白的影响

此外，利用前期构建的PKM2 敲低细胞系［15］，用免疫印迹的方法检测PKM2 对EMT 相关蛋白的影响。结果显示，敲低PKM2 后，A549细胞中的E-cadherin 明显上调，而N-cadherin、Vimentin 明显下调（图5）。这些结果证明PKM2 能够通过影响EMT 相关蛋白的表达促进肿瘤的发展。

图5 敲低PKM2对EMT的影响Fig.5 Effect of PKM2 knockdown on EMT

3 讨论

肿瘤的发展是一个十分复杂的过程，涉及到基因表达的改变。因此，研究肿瘤中基因的异常表达对寻找肿瘤标志物及治疗靶点具有重要意义。尽管不同肿瘤的免疫化学染色实验揭示了PKM2 在多种肿瘤组织中的存在。多项研究表明PKM2 在结直肠癌患者中表达上调［16-18］。但其是否能作为广谱的肿瘤标志物及靶点并不清楚，且其作用机制也有待于进一步研究。我们前期的研究发现，PKM2 在肺癌的表达水平显著高于正常组织，且胞外PKM2 可以作为肺癌的诊断标志物［15］。本研究中，我们利用TCGA 数据库分析了PKM2 在33 种肿瘤中的表达量，发现其中包括肺癌在内的15 种肿瘤中PKM2 的表达水平显著高于正常组织，并且其中9 种肿瘤中，PKM2 的表达与生存显著相关。此外，本研究还检测了不同恶性程度的小鼠黑色素瘤细胞中PKM2 的表达，结果显示，恶性程度高的黑色素瘤细胞中的PKM2水平显著高于恶性程度低的黑色素瘤细胞。因此，本实验结果为PKM2 成为广谱的肿瘤标志物奠定了基础。

大量的证据表明，肿瘤细胞会主动释放出大量的外泌体、凋亡小体或微粒体，以便与微环境进行交流，从而促进肿瘤的恶性进展。这些胞外小泡在肿瘤细胞的快速发展［19-20］中起着至关重要的作用。有研究报道，PKM2 通过磷酸突触体相关蛋白质23 促进外泌体的释放，该过程反过来又促进了SNARE 复合体的形成［20］。Hsp90α 作为一个重要的分子伴侣蛋白，已经被广泛报道参与肿瘤的发展［21-22］。近期我们与其他团队合作的研究显示，Hsp90α 能够通过外泌体的形式被分泌到胞外［22］。且胞外Hsp90α 能够促进肿瘤的恶性进展［23-24］。在该研究中，我们发现PKM2 能够促进Hsp90α 的分泌。我们前期的研究证明，敲低PKM2 能够抑制A549 肿瘤细胞的迁移能力［15］。在本研究中，进一步证明了过表达PKM2 能够促进肿瘤细胞的增殖和迁移。因此，PKM2 可以通过调控Hsp90α的分泌从而促进肿瘤的进展。

增长的证据表明转移的一个显著特点是上皮到间充质的转化（epithelial-mesenchgmal transition，EMT）。EMT 蛋白水平的变化，包括E-cadherin 的降低，以及N-cadherin 和Vimentin 的升高，都可以提示肿瘤细胞EMT 的发生，从而促进肿瘤的转移［25］。有研究报道PKM2 进入核内后会抑制上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）的活性［26］。在细胞核中，PKM2 与TGIF2 相结合，将HDAC 带到CDH1基因的启动子区，导致组蛋白H3 的脱乙酰化以及编码E-cadherin 的CDH1基因表达的降低。因此，E-cadherin 的转录被抑制，导致EMT 的丧失，从而促进细胞入侵和转移［27］。本研究中，在肺癌细胞中敲低PKM2后，发现E-cadherin的表达量增加，同时检测到N-cadherin和Vimentin表达量降低。同样证明了PKM2 可能通过调控E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 的表达影响肺癌细胞的EMT过程，从而影响肿瘤的转移。

综上所述，本研究发现15 种肿瘤组织的PKM2表达量高于正常组织，且9种肿瘤的生存率与PKM2 的表达量显著相关。因此，为PKM2 成为一个广谱的肿瘤标志物提供了理论依据。此外，本研究发现高表达PKM2 可以促进肺癌细胞的增殖和迁移，且过表达PKM2 能够促进Hsp90α的分泌及EMT 的抑制，揭示了PKM2 促进肿瘤进展的新机制。PKM2促进Hsp90α的分泌机制还有待于进一步研究。PKM2 能否成为广谱的肿瘤标志物还需要加大样本进行临床试验。总之，本研究为PKM2 作为广谱肿瘤标志物提供了进一步的证据，为靶向PKM2的治疗提供了新的理论依据。