红花水提液对博来霉素诱导的系统性硬皮症小鼠皮肤和肺纤维化的影响▲

李永强 黄奕 周雪艳 赵亮娟 吕军影

1 广西医科大学第一临床医学院，南宁市 530021；2 广西医科大学第一附属医院，南宁市 530021

系统性硬化症(SSc)是一种自身免疫性风湿性疾病，其主要特征是机体出现严重的多系统结缔组织纤维化。间质性肺疾病(ILD)是SSc患者的常见并发症，是患者最常见的死亡原因，患者预后差[1]。系统性硬化相关性ILD(SSc-ILD)的发病机制目前尚不清楚，非选择性免疫抑制剂如环磷酰胺、霉酚酸酯和硫唑嘌呤是临床治疗SSc-ILD患者的常用药物[1]。一些研究结果[2-3]显示，活血化瘀中药治疗能较好地改善机体的肺纤维化，其中红花是最常用的活血化瘀药物之一。本课题组的前期研究结果显示，红花水煎液能明显降低SSc小鼠肺组织的羟脯氨酸含量，具有很好的抗肺纤维化作用[4]。博来霉素诱导的SSc小鼠的典型特征是皮肤和肺组织发生明显的病理学改变，皮肤真皮显著增厚、硬化，伴肺组织Ⅰ型胶原(COLI)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)过度表达，与人类SSc患者的组织学特征非常相似[5-7]。为探讨红花水提液的抗纤维化作用机制，本研究观察了红花水提液对博来霉素诱导的SSc小鼠肺组织COLI、α-SMA表达水平等的影响。

1 材料与仪器

1.1 实验动物 24只7周龄近交系BALB/C小鼠，SPF级，雌性，体重(20±2)g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(湘)2019-0004。小鼠在广西医科大学实验动物中心室温20～25℃、相对湿度50%～70%的清洁环境中分笼饲养，光/暗12h循环；小鼠可自由获取食物和水。本实验方案及操作经广西医科大学动物实验委员会审查批准，符合实验动物伦理学要求。

1.2 主要药物和试剂 (1)将注射用盐酸博来霉素(浙江海正药业股份有限公司)溶于无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中，制成200 μg/mL缓冲液，过滤除菌后分装于EP管中，4℃保存备用。(2)将中药红花(批号190701921，产地四川，购自广西医科大学第一附属医院药房)采用常规方法加水煎煮并浓缩成1 g/mL的红花水提液，使用纯水配制成浓度为0.15 g/mL的使用液，4℃保存备用。(3)RNAwait(非冻型组织RNA保存液)购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗小鼠COLI多克隆抗体购自武汉云克隆科技股份有限公司，兔抗小鼠α-SMA抗体购自武汉塞维尔生物科技有限公司。

1.3 仪器 Olympus正置四色荧光显微镜(型号：BX53)； StepOneTM荧光定量 PCR 仪；Centrifuge 5417C高速冷冻离心机(Eppendorf)；JY300E通用电泳仪(北京君意)；NanoDrop2000c(Thermo Scientific)。

1.4 方法 小鼠适应性饲养1周后，采用随机数字法分为对照组、模型组、红花干预组，每组8只。参照文献[8]剃去各组小鼠背部中央区相同部位面积约2 .0 cm×2.0 cm的被毛，对照组小鼠在背部脱毛区皮下注射PBS 0.1 mL，1次/d；模型组、红花干预组小鼠在背部脱毛区皮下注射博来霉素磷酸盐缓冲液(200 μg/mL)0.1 mL，1次/d，三组小鼠均连续注射28 d。红花干预组小鼠从皮下注射博来霉素开始后，给予红花使用液0.2 mL/d灌胃，连续灌胃28 d；对照组和模型组小鼠给予等容量生理盐水灌胃，连续灌胃28 d。干预期间，各组小鼠自由饮水进食。干预结束后，小鼠自由饮水进食1天，禁食不禁水1天，第3天，给所有小鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(3 mL/kg)麻醉处死，取背部注射区皮肤及肺组织，一部分采用4%多聚甲醛溶液固定，脱水，石蜡包埋，4 μm厚连续切片；一部分放入EP管中，加入适量的非冻型组织RNA保存液，-80℃保存，用于q-PCR检测。

1.5 观察指标

1.5.1 一般情况 比较三组小鼠干预期间的活动度、背部注射区皮肤及脱毛区毛发生长情况、反应度、体重等。

1.5.2 皮肤和肺组织病理学检查 取小鼠皮肤、肺组织切片行HE染色和Masson染色，光学显微镜下观察皮肤和肺组织病理学改变。参照文献[9]，对肺组织切片进行肺纤维化程度评分。

1.5.3 肺组织 COLI、α-SMA表达情况 采用免疫组化SABC法检测小鼠肺组织的COLI、α-SMA表达情况，采用Image Pro Plus软件进行定量分析。COLI、α-SMA蛋白阳性判定标准：以胞质内呈现棕黄色颗粒为阳性反应，反之为阴性反应；随机选取6个高倍视野(×400)，用Image Pro Plus软件检测每个视野下染色区域的光密度，计算平均光密度(AOD)=累积光密度/阳性面积。

1.5.4 肺组织COLI-a1、COLI-a2、α-SMA的mRNA表达水平 参照试剂盒说明书，采用q-PCR检测小鼠肺组织COLI-a1、COLI-a2、α-SMA表达水平。COLI-a1、COLI-a2、α-SMA的mRNA相对表达量分析采用循环数(Ct)值法(2-△△Ct法，荧光强度达阈值时)，即相对表达量=2-△△Ct，△Ct=Ct目标基因-Ct内参基因，△△Ct=△Ct实验组-△Ct对照组。由北京擎科生物科技有限公司设计并合成PCR引物序列。

引物序列：

COLI-a1 F(AGCACGTCTGGTTTGGAGAG)

R(GACATTAGGCGCAGGAAGGT)

COLI-a2 F(TACAACGTAGAAGGGGTGTCCT)

R(TGCAGTGGTAGGTGATGTTCTG)

α-SMA F(CCAGCCATCTTTCATTGGGATG)

R(ACAGGACGTTGTTAGCATAGAGA)

内参基因：F(ACTCTTCCACCTTCGATGCC)

R(TGGGATAGGGCCTCTCTTGC)

1.6 统计学处理 采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析。计量资料以x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组小鼠干预期间的一般情况比较 干预过程无小鼠死亡。对照组小鼠精神好，反应灵敏，饮水和进食正常，体质量增加，背部注射区皮肤轻度增厚、无硬化现象，脱毛区毛发生长迅速，大便软硬适中、量正常；模型组小鼠精神差、活动性差，体质量下降明显，背部注射区皮肤硬化明显，饮水进食减少，大便干硬、量偏少；红花干预组小鼠精神较模型组好，活动性好，脱毛区毛发有不同程度生长，体质量轻度下降。三组小鼠的体质量变化见图1。

图1 三组小鼠干预期间的体质量变化情况比较

2.2 三组小鼠皮肤和肺组织的病理学变化情况比较 干预结束后第3天处死小鼠。对小鼠皮肤进行HE染色和Masson染色检查，结果显示：(1)对照组小鼠皮肤组织结构完整，可见零星散在的少量炎症细胞。(2)模型组小鼠皮肤真皮层明显增厚，胶原纤维明显增粗、膨大、数量增多、排列紧密、呈均质化改变，可见大量炎症细胞浸润，包括淋巴细胞、组织细胞和少许浆液，脂肪组织并入到真皮内；皮肤附属器萎缩，减少。(3)与对照组比较，红花干预组小鼠皮肤真皮层增厚，少量淋巴细胞浸润，胶原纤维排列紊乱，数量增多；与模型组比较，小鼠皮肤真皮层变薄，淋巴细胞等炎症细胞浸润减少，胶原纤维数量减少。见图2、图3。 肺组织HE染色和Masson染色检查结果显示：(1)对照组小鼠肺泡结构完整，无明显胶原纤维增生，可见散在的少量炎症细胞。(2)模型组小鼠肺部结构破坏、紊乱，肺泡间隔断裂，肺泡内出血，肺间质、肺泡和支气管壁可见大量炎症细胞浸润，胶原纤维增厚。(3)红花干预组小鼠肺泡间隔轻中度增厚，少量中等量炎症细胞浸润，胶原纤维增生。见图4、图5。

图2 三组小鼠皮肤HE染色(×200， A为对照组，B为模型组，C为红花干预组)

图3 三组小鼠皮肤Masson染色(×200，A为对照组，B为模型组，C为红花干预组)

图4 三组小鼠肺组织HE染色(×200，A为对照组，B为模型组，C为红花干预组)

图5 三组小鼠肺组织Masson染色(×200， A为对照组，B为模型组，C为红花干预组)

2.3 三组小鼠的肺纤维化程度评分比较 干预结束后第3天处死小鼠。对小鼠肺组织进行HE染色和Masson染色检查，结果显示：模型组、红花干预组小鼠肺纤维化程度评分显著高于对照组，红花干预组小鼠肺纤维化程度评分显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.001)。见图6。

图6 三组小鼠的肺纤维化程度评分比较

2.4 三组小鼠肺组织的COLI、α-SMA表达水平比较 对照组小鼠肺组织中的COLI、α-SMA呈微弱表达；模型组小鼠肺组织中的COLI、α-SMA呈强阳性表达；红花干预组小鼠肺组织中的COLI、α-SMA呈中等强度阳性表达。见图7、图8。模型组、红花干预组小鼠肺组织的COLI、α-SMA表达水平(肺组织的AOD)显著高于对照组，红花干预组小鼠肺组织COLI、α-SMA表达水平显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

图7 三组小鼠肺组织COLI的表达情况(×400，A为对照组，B为模型组，C为红花干预组)

图8 三组小鼠肺组织a-SMA的表达情况(×400，A为对照组，B为模型组，C为红花干预组)

表1 三组小鼠肺组织的AOD比较 (n, x±s)

2.5 三组小鼠肺组织COLI-a1mRNA、COLI-a2mRNA、α-SMA mRNA表达水平比较 模型组小鼠肺组织的COLI-a1mRNA、COLI-a2mRNA、α-SMA mRNA表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；红花干预组小鼠肺组织的COLI-a1mRNA、COLI-a2mRNA、α-SMA mRNA表达水平显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图9。

图9 三组小鼠的肺组织COLI-a1mRNA、COLI-a2mRNA、α-SMA mRNA表达水平比较

3 讨 论

SSc-ILD被认为是纤维化、自身免疫、炎症和血管损伤相互作用的结果，其特征是肺组织成纤维细胞、肌成纤维细胞数量显著增加，细胞外基质堆积，导致机体发生慢性呼吸衰竭或致死性肺动脉高压[10-11]。活化的成纤维细胞和肌成纤维细胞是肺纤维化的关键效应细胞，在肺纤维化过程中，成纤维细胞被激活、增殖和分化为对细胞因子、趋化因子和生长因子等高度敏感的肌成纤维细胞，从而刺激细胞外基质的过度产生，细胞外基质中的纤维性蛋白如Ⅰ型和Ⅲ型胶原、层粘连蛋白和纤维连接蛋白等比例增高，最终发生纤维化[12-14]。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是判断肌成纤维细胞活化水平最常用的标志物[15-17]。

目前，临床上对SSc-ILD患者一般给予免疫调节治疗，但非选择性免疫抑制剂具有毒性，短期使用可导致白细胞减少和感染，而长期使用可能会导致不孕、发生骨髓毒性和致癌。目前所研发的针对器官组织的特异性抗纤维化药物很少直接针对肌成纤维细胞，更多的是针对调节激活信号或细胞内级联的药物，因此，针对肝、肾或肺肌成纤维细胞的药物靶向治疗研究是一个新的方向[17-18]。

中药红花，又名刺红花、怀红花、草红花和金红花，为菊科植物红花的干燥花，其味辛性温，归心、肝经，有活血通经、祛瘀止痛的功效。红花含有黄酮、生物碱、聚炔、亚精胺、甾醇、木脂素、多糖等多种成分，具有抗心肌缺血、调节血流动力学、抗炎、抗氧化、调节免疫等药理作用[19]。一些研究结果显示，活血化瘀类中药能较好改善患者的肺纤维化状况，中药红花具有抗肺纤维化的作用[20-23]。

本研究结果显示，红花水提液可明显改善SSc小鼠皮肤和肺组织的病理学状况，减少皮肤和肺组织的炎症细胞浸润及胶原纤维沉积，降低小鼠肺纤维化程度，提示红花水提液具有较好的抗纤维化作用；红花水提液可下调SSc小鼠肺组织的COLI、α-SMA表达水平以及COLI-a1mRNA、COLI-a2 mRNA、α-SMA mRNA表达水平，提示红花水提液可能是通过降低COLI、α-SMA含量，减少肌成纤维细胞及细胞外基质的生成和堆积而发挥抗纤维化的作用。