功能性消化不良动物模型的研究进展

陶睿智 ,顾任钧 ,夏雅雯 ,韩鸿宽 ,陆可沁 ,陆茵 ,孙广志*

(1.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,南京中医药大学,南京 210000;2.南京中医药大学第二附属医院,南京中医药大学,南京 210000)

功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是以上腹痛、上腹胀满、早饱、嗳气、食欲不振、恶心、呕吐等为主要症状[1],排除器质性疾病后的一组临床综合征,是临床最常见的功能性胃肠疾病之一[2]。该疾病人群患病率在全球范围内变化很大,西方国家的总体患病率较高(10%～40%),亚洲的患病率较低(5%～30%)[3]。FD 作为一种慢性疾病,在病程上具有周期性和波动性的特点[4]。罗马IV 将FD诊断标准总结为:在过去3 个月中每周至少有3 d伴有消化不良症状,发病在6 个月以上,并且不能通过排便而得到缓解[5-7]。

动物模型已被广泛用于确定FD 的病理机制的研究,世界各地的研究人员尚未开发出针对FD 特定的模型和药物[8]。FD 在病程上有持续时间的特征[5-7],造模的成功时间与效果的持续时间对于实验者操作以及模型合理性都有重要参考价值,但目前缺少全面概括现有模型持续效果的文章。检索国内外文献,通过分析近几年发表的FD 的造模方法,从作用机制影响效果的长短将其大致分为持续型和临时型两类[9],这两类模型在导致FD 的机制上有着不同特点。由于FD 的发病机制尚未完全明确,内脏高敏感[10]、胃顺应性降低[11]、胃排空延缓[12]目前被认为是FD 的关键病理机制,焦虑也是FD 患者的常见心理状态[13]。临时型FD 模型主要通过急性压力刺激、药物临时干预来达到短暂的胃肠动力障碍、内脏敏感性增加以及肠道炎症等;持续型FD 模型主要通过长期慢性刺激、长期药物干预以及长期多因素干预的方法造成动物胃肠动力障碍、内脏敏感性增高以及胃肠激素紊乱等来模拟FD 的症状。

本文希望从持续效果来进行FD 动物模型的分类与整理,以期对FD 的研究提供帮助。

1 临时型FD 模型

1.1 浸水压力应激

Lee 等[14]选取16～18 周的SD 大鼠(250～300 g),用浸水约束压力进行造模。该课题组设置了2 h 压力组和4 h 压力组,大鼠身体被固定在铁笼内,除了头部以外身体浸没在水中(19 ± 1)℃,分别持续2 h 和4 h。处死大鼠后测定大鼠十二指肠组织中occludin 和ZO-1 蛋白和mRNA 水平以评价炎症,血浆中ACTH 和皮质醇的水平以评价应激状态。与空白组相比,4 h 组occludin 和ZO-1 蛋白及mRNA 水平明显降低,ACTH 及皮质醇水平明显升高。该模型通过应激改变肠上皮通透性来诱导炎症,从而模拟FD 的原发部位之一即十二指肠区域的病理变化。

1.2 酸化刺激

Shin 等[15]选择ICR 小鼠21～26 g,在末次给药30 min 后,腹腔注射溶于生理盐水的0.6%的醋酸(10 mL/kg)来进行造模,同时灌胃给予5%伊文斯兰溶液(0.1 mL/kg),30 min 后处死小鼠来测定小肠推进率,与正常组相比推进率明显降低。Mine等[16]给予大鼠结肠注射0.6%的醋酸,造成其内脏运动反应(visceromotor response,VMR)明显增加,从而制备SD 大鼠内脏高敏感性FD 动物模型;Kim等[17]选取成年雄性ICR 小鼠,在末次给药30 min后,腹腔注射0.5%的醋酸,30 min 后处死,观察小肠推进率明显降低。Chen 等[18]选取成年SD 大鼠,利用手术结肠滴注4%醋酸(1 mL)来进行炎症后肠易激综合征模型的制备,结果发现该模型能使大鼠的胃肠动力明显紊乱该类模型造模时间短且效果明显,能短暂引起胃内压升高,模拟FD 模型。

1.3 顺铂注射

毕娉娉等[19]选取KM 小鼠,腹腔注射顺铂2 mg/kg,连续4 d 进行造模。检测相关指标发现小鼠胃排空延缓对照组为 64.03%,而模型组为93.86%。同时,小肠推进显著增加,对照组为56.07%,模型组为73.18%。张广龙等[20]利用顺铂注射液进行造模,在首次给药60 min 后,给予成年SD 大鼠腹腔注射顺铂注射液(6 mg/kg),于4 d 后处死,测定胃中的残留量,结果显示模型组胃残留率(87.9%)明显高于对照组(44.8%)。Shin 等[15]同样通过腹腔注射给予ICR 小鼠5 mg/kg 的顺铂注射液来延缓小鼠胃排空,使小鼠胃动力下降。

1.4 受体阻断剂/激动剂注射

1.4.1 阻断M 受体

Chang 等[21]选取成年KM 小鼠,通过末次给药1 h 后,腹腔注射阿托品注射液(1.5 mg/kg)来复制胃肠动力障碍模型。测定胃排空率以及激素变化来评价小鼠胃肠动力的变化;放射免疫法测试大鼠胃肠激素在体内血浆、胃窦、十二指肠、下丘脑含量的变化。结果表明,阿托品组胃排空能力降低,小肠推进率降低,胃泌素含量下降,血管活性肠肽含量升高,造模成功。Zhang 等[22]选取8 周龄SD 大鼠,腹腔注射1 mg/kg 的阿托品,15 min 后观察胃慢波频率,发现其频率紊乱。

1.4.2 阻断阿片受体

He 等[23]选取KM 小鼠进行慢性便秘(STC)造模,灌胃给予小鼠10.0 mg/kg 洛哌丁胺每天2 次,持续10 d。对排便频率、湿便重、干便重进行评估。Shin 等[15]通过腹腔注射给予ICR 小鼠5 mg/kg 的洛哌丁胺来延缓小鼠胃排空(空白组为50.2%,模型组为34.9%),造成胃肠动力障碍。

1.4.3 激动α2 肾上腺素受体

Mine 等[16]利用可乐定(0.03 mg/kg)给予ddY小鼠皮下注射来进行FD 动物模型的造模,能够引起内脏运动反应增加,改变干湿便重;邹璇[24]选取200 g 左右的成年SD 雄性大鼠,在末次给药后30 min,给予模型组以及给药组皮下注射100 μg/kg 可乐定(CD)进行造模并30 min 后对模型进行评价,其胃顺应性及胃排空率均下降。

1.4.4 激动多巴胺受体

Kanemasa 等[25]选取6 周成年Wistar 大鼠,末次给药15 min 后,皮下注射3 mg/kg 或口服20 mg/kg 吗啡来模拟胃肠动力障碍模型,60 min 处死后测定小肠推进,发现同对照组相比明显降低;同样,Mine 等[16]利用吗啡(1 mg/kg)皮下注射复制ddY小鼠FD 模型,能够造成内脏运动反应增加。

2 持续型模型

2.1 长期高脂饮食

Zhou 等[26]选取雄性SD 大鼠(100～150 g),空白组给予普通饮食(11.3%大卡的脂肪),模型组给予高脂饮食(58%大卡的脂肪),给予2 周后,处死动物并测定胃排空率,发现高脂饮食大鼠排空率降低了26%。

2.2 慢性压力应激

Liang 等[27]选取雄性Wistar 大鼠(180～220 g),通过夹尾使大鼠焦虑和紧张,持续30 min 后,让大鼠以适当速度在特定跑步机上跑步10 min,使大鼠疲劳。每日4 次,连续10 d。测定胃排空率、小肠推进率以及血清MTL、VIP 等水平,发现胃排空率和小肠推进率明显降低,MTL 较对照组明显降低,VIP水平明显升高。大鼠胃肠蠕动减慢,出现运动障碍,符合FD 的特征。谭树慧等[28]通过对SD 大鼠每次随机采用慢性应激束缚、食物剥夺、过度疲劳等刺激方式复制FD 动物模型,相邻2 d 采用不同的慢性刺激方式,连续刺激21 d。此法认为大鼠长期受到不规律的慢性刺激,长期处于应激状态下,出现FD 症状。范梦男等[29]采用改良郭氏夹尾刺激法联合张氏不规则喂食法复制雄性SD 大鼠FD 模型。将使用纱布包裹的夹钳连续不断地夹大鼠尾巴末端1/3 处,每次夹尾刺激持续30 min,每天1 次,以此激怒大鼠并使其互相厮打,连续21 d。王璟等[30]、王敏等[31]采用了夹尾激怒加不规律饮食法造模。此法相对缓和,每日夹尾次数下降,通过长期的夹尾刺激引起大鼠内脏敏感性增加,贴合临床FD 的症状。

2.3 c-Kit 单克隆抗体注射

陈峭等[32]选取SD 大鼠,腹腔注射抗c-Kit 单克隆抗体(ACK2)各100 μg,2 d 1 次,连续5 次。2 周后取材前给予大鼠半固体糊,30 min 后测定胃残留率、小肠推进率以及Cajal 细胞超微结构。结果发现与对照组相比,模型组胃残留率显著增加,小肠推进率显著减少,Cajal 间质细胞呈凋亡样改变,从而造成小鼠持续胃肠动力障碍。

2.4 碘乙酰胺灌胃

吕林等[33]采用碘乙酰胺灌胃结合改良小平台法。选取10 只SD 幼鼠,给予0.1%蔗糖碘乙酰胺溶液灌胃(0.2 mL/d),连续灌胃6 d。出生后第43天,给予改良小平台法处理,造成小鼠劳倦,每日持续14 h,连续14 d。检测抓力、胃排空率、小肠推进率、胃体纵行肌和胃窦环形肌条收缩力均降低;吴震宇等[34]选取9 只10 日龄SD 大鼠,给予每天0.2 mL 灌胃,持续6 d。灌胃结束后各组大鼠正常饲养至7 周龄,7 周龄起以郭氏夹尾刺激至8 周龄。检测大鼠胃敏感性及顺应性、胃排空率等指标均降低。同样Zhang 等[22]通过选取10 日龄SD 大鼠灌胃给与2%蔗糖的0.1%碘乙酰胺溶液(每天0.2 mL)进行FD 的造模,能够减慢大鼠胃排空,造成胃慢波频率紊乱。

2.5 三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)注射

Winston 等[35]选取10 日龄雄性SD 大鼠,从其肛门向结肠中插入2 cm 导管,肠内注射0.2 mL 用10%乙醇溶解的三硝基苯磺酸(130 mg/kg),将动物以朝下的姿势保持约2 min,并保持肛门闭合1 min,以防止TNBS 溶液泄漏来诱导新生儿动物结肠炎。给予液体营养餐并进行大鼠饱腹感和胃排空检测,结果表明模型大鼠与空白组相比进食量减少且胃排空延迟。该方法选取10 日龄动物造成其幼年损伤,引发炎症及内脏高敏感,持续效果时间长。

2.6 新型序贯应激法

景富春等[36]运用新生幼崽胃刺激法和母婴分离法2 种方法并结合束缚应激法刺激幼龄动物,造成焦虑,从而建立持续型胃高敏感大鼠模型。该课题组选取1 日龄SD 大鼠,自出生后第2 天起,每天与母鼠分离3 h,至3 周结束。同时幼鼠于出生后第10 天起给予0.1%碘乙酰胺的2%蔗糖溶液灌胃(每只0.2 mL),持续6 d,并于第8 周进行束缚应激实验,持续90 min 后放回原笼,持续7 d。分别于灌胃后第2～6、18、56 天进行称重,进行矿场试验、胃排空试验,评价胃黏膜炎症反应等。结果表明,模型组大鼠体重低于空白组,胃排空率降低,大鼠在中央格停留时间、穿行格数、直立次数明显减少,符合焦虑样FD 模型。

3 总结

本文通过对近年来FD 动物模型的整理(见表1),初步根据造模时间和持续效果时间的长短将FD动物模型分为临时型和持续型。总结发现临时型造模方法主要有急性刺激、药物干预等。其中浸水约束压力主要利用急性压力会破坏肠道稳态,短暂引起十二指肠和胃运动障碍[14],通过增加黏膜GDNF 扩增ISC 和EC 细胞分化诱导内脏超敏反应[37];酸化刺激导致胃排空延迟,胃肠功能调节障碍以及内脏超敏感[38];顺铂等化疗药物可作用于延髓呕吐中枢,并直接损伤胃黏膜从而引起呕吐恶心等胃肠道毒副反应[39];阿托品、洛哌丁胺、可乐定、多巴胺可分别阻断胃肠道平滑肌的受体如M 受体[40]或阿片受体[41]以及激动α2 肾上腺素受体[16]、多巴胺受体[42]来松弛平滑肌从而造成胃肠动力障碍,模拟FD 的症状。该方法持续效果较短,药物代谢之后,胃肠动力恢复,具有起效快,造模简单的优点,可以基本模拟FD 临床上腹痛及烧灼或便秘等症状。该模型以胃排空率、小肠推进率降低及胃肠激素紊乱为指标,多选用成年动物。

持续型造模方法主要有慢性刺激、药物干预、母婴分离、不规则喂食等。其中慢性高脂饮食通过上调胃肌层神经丛中胆汁酸受体TGR5 和nNOS,影响胃肠激素水平如GLP-1 的表达来延缓胃排空[26];持续压力通过影响胃肠动力以及激素的分泌,造成持续性的胃肠敏感性增加、功能障碍和消化不良[43];体内注射c-Kit 单克隆抗体(ACK2),可以造成肠道动力基本单位Cajal 间质细胞损伤[44-45],从而导致小肠的异常运动[46];碘乙酰胺通过诱导细胞缺氧、胃肠黏膜损伤从而引起动物焦虑和抑郁[47],造成动物胃肠道固有损伤及炎症反应;三硝基苯磺酸通过引起Th1 型炎症反应[48]来造成胃肠动力障碍。该模型可以基本模拟FD 临床上焦虑、早饱、食欲不振等症状[49-50],以动物体重下降,进食量减少,胃排空率及小肠推进率下降、胃肠激素紊乱为评价指标,既可选用成年动物,也可选用幼年动物。

临时型造模模型成功时间多在当天,在模拟症状方面效果明显,适用于针对某一症状的动物实验研究,其持续效果也相对短暂,多利用当天进行模型评价。但临时型往往难以从整体上反应FD 的病证[51],其在效果上还有待改进。如今脑-肠轴以及肠道菌群的研究成为热点[52],压力已被证明对于脑-肠轴具有深刻影响,是多种慢性消化系统疾病和肠道型炎症疾病的诱因[53],神经胃肠病学与FD 存在着密切联系[54]。临床上FD 大多病程迁延,大约50%患有FD 的人有持续性症状[4],其与患者的社会心理状态以及压力影响有关。采用持续型方法进行FD 造模虽然造模时间长,但可以基本模拟病人焦虑以及压抑的特点,表现出FD 作为慢性消化道疾病的症状,与临床具有更高的吻合度。

表1 FD 动物模型汇总表Table 1 Summary of FD animal models

续表1

现今FD 的病因病机还不完全明确,并没有一个模型能够完全模拟FD 的症状,临床与模型间的“沟堑”客观存在,这需要科研工作者从临床出发,进行更进一步的研究。发病部位及机制上,应聚焦于上消化道。胃以及十二指肠的功能紊乱是FD 病理生理学的基础,对FD 中胃及十二指肠病理学的细致认识有助于我们发现新的生物标记物和治疗靶点;动物模型的选择和探究上,应当分型论治,先明确功能性消化不良的亚型及其区别,寻找稳定可靠具有代表性且的动物模型。