四物合剂对缩宫素所致原发性痛经模型小鼠的影响研究

刘子馨 贾飞凡 孟红旭韩 笑李玲美尤 越王奥奥王紫艳杨 斌李 磊*付建华*刘建勋

(1.中国中医科学院西苑医院基础医学研究所,北京 100091；2.国家中医心血管病临床医学中心,北京 100091；3.中药药理北京市重点实验室,北京 100091；4.解放军总医院第六医学中心,北京 100048；5.中国中医科学院西苑医院病理科,北京 100091)

原发性痛经(primary dysmenorrheal,PD)是指伴随月经周期出现以下腹部疼痛为主要症状且无其他生殖器官器质性病变的疾病,是最常见的妇科疼痛性疾病,占痛经的90%以上[1],在不同年龄、国籍的女性人群中发病率占45%～97%不等,可以占到学校与工作缺勤原因的1%～3%[2]。原发性痛经属于中医“经行腹痛”的范围。清代陈莲舫所著《女科秘诀大全》中将经行腹痛称为“痛经”,后世医者沿用此名。针对原发性痛经的治疗,西医临床常使用非甾体抗炎药和避孕药[3],此类药物主要作用靶点为前列腺素,通过抑制前列腺素缓解疼痛[4]。然而长期使用非甾体抗炎药和口服避孕药对肝、肾、胃肠功能甚至心脏系统都有许多副作用[5]。中医临床常使用四物汤及其类方或佐以针灸、穴位贴敷、耳穴、熏蒸、灌肠等方法,疗效显著且副作用少[6-8]。四物合剂始载于2000 年版《中国药典》一部[9],源于中医经典方剂“四物汤”其组成成分为:当归、熟地黄、白芍、川芎。四物汤最早记载于唐代蔺道人所著的《仙授理伤续断秘方》,后世应用较为广泛的药方则取自宋代《太平惠民和剂局方》中,具有调经止痛、补血活血的功效,主治冲任虚损、月水不调……经行腹痛等妇人诸疾[10]。方中当归补血养肝,和血调经,熟地黄补血滋阴,佐以白芍和营柔肝,川芎活血行滞,通畅气血,被称为“妇科第一方”是治疗妇科疾患的基础方。通过网络药理学研究分析得出四物汤治疗PD 的关键作用机制为舒张子宫、调节激素、抗炎镇痛等[3]。基于此,本研究旨在探究四物合剂治疗原发性痛经的作用及其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

KM 雌性小鼠60 只,SPF 级,体重18～22 g,由维通利华实验动物技术有限公司提供[SCXK(京)2021-0006]。动物饲养、实验操作均在中国中医科学院西苑医院实验动物中心[SYXK(京)2018-0018]进行。实验动物处置严格遵循“减少、替代、优化”的3R 原则,给予人道主义关怀。本研究获得中国中医科学院西苑医院动物伦理委员会批准(2022XLC001)。

1.2 主要试剂与仪器

四物合剂,神威药业(四川)有限公司提供,每瓶10 mL,批号2001141,有效期至2022 年1 月,根据2020 年版《中国药典》一部计算,每1 mL 四物合剂相当于1 g 生药；缩宫素注射液,上海禾丰制药有限公司,1 mL:10 单位,批号:09201009,有效期至2022 年10 月；苯甲酸雌二醇注射液,宁波第二激素厂,2 mL:4 mg,批号:2011051,有效期至:2022 年10月；痛经宝颗粒,仲景宛西制药股份有限公司,每袋10 g,批号:200704。

丙二醛(SOD)测定试剂盒:南京建成生物工程有限公司,货号:A001-3-2；超氧化歧化酶(MDA)测定试剂盒:南京建成生物工程有限公司,货号:A003-1-2；前列腺素F2α(PGF2α)ELISA 试剂盒:上海江莱生物科技有限公司,货号:JL13273；白介素6(IL-6)ELISA 检测试剂盒:上海酶联生物科技有限公司,货号:ml002293-C；肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒:上海酶联生物科技有限公司,货号:ml002095-C；环氧合酶-2 抗体(COX-2):proteintech,货号:66351-1-lg。多功能酶标仪:BioTek 公司(美国)SYNERGY44型；低温冷冻离心机:Thermo Fisher Scientific 公司(美国)MP-150 型。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

正常雌性小鼠60 只,随机均分成4 组,即空白组、模型组、阳性药痛经宝颗粒组(4 g/kg)、四物合剂组(8 mL/kg),按照药品说明书给药方式设置给药剂量,适应性饲养3 d 后各组给予相应药物灌胃给药。

1.3.2 造模与给药

小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇(2 mg/kg),每日1次,连续10 d。第4 天开始,空白组与模型组给予等剂量蒸馏水,痛经宝组按4 g/kg 给药,四物合剂组每日按8 mL/kg 给药,每日给药1 次,连续给药7 d。

1.3.3 扭体次数、潜伏期测定

末次注射苯甲酸雌二醇后1 h,按10 U/kg 腹腔注射缩宫素,制备小鼠原发性痛经模型。小鼠腹腔注射10 U/kg 缩宫素后,即刻放入透明的观察箱中,观察记录小鼠首次出现扭体时的潜伏期以及小鼠30 min 内所有扭体次数,计算出药物扭体反应抑制率。观察标准:小鼠腹腔出现内凹,以及躯干与后肢伸展,臀部与一侧肢体内旋。抑制率(%)=(模型组扭体反应均数-给药组扭体反应均数)/模型组扭体反应均数×100%。

1.3.4 血清MDA、SOD 检测

观察出现扭体反应30 min 后,进行小鼠麻醉。小鼠眼底静脉丛取血放至不含抗凝剂试管中,室温下静置1 h 后,3500 r/min 离心,离心10 min 后取上清。用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)检测血清SOD 活性,硫代巴比妥酸(TBA)法测定血清MDA 含量。

1.3.5 ELISA 法检测子宫组织PGF2α、IL-6、TNF-α

小鼠眼底静脉丛取血后,冰上迅速摘取小鼠新鲜的子宫组织,预冷的PBS 冲洗子宫组织,去除残留血液,称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS 按1 ∶9 加入匀浆器中,充分研磨,将匀浆液于7300 r/min,离心10 min,取上清检测。ELISA 检测子宫组织PGF2α、IL-6、TNF-α 的含量。以上均严格按照说明书要求操作。

1.3.6 子宫HE 染色与免疫组化

取出子宫组织后用4%多聚甲醛固定24 h 后,石蜡包埋,制备子宫组织切片,HE 染色后显微镜下观察子宫组织。石蜡切片常规脱蜡至水,0.3%H2O2氧化15 min,PBS 洗3 遍,每遍5 min,滴加一抗COX-2(1 ∶200 稀释)4℃过夜,PBS 洗3 遍,每遍5 min,滴加EnVision II 抗,室温60 min,PBS 洗3遍,每遍5 min。每张切片加100 μL 新鲜配制的DAB 溶液,显微镜下观察3 min,阳性显色为棕色。蒸馏水洗终止染色,苏木素复染,0.1%盐酸分化,自来水冲洗,PBS 冲洗返蓝,梯度乙醇脱水,透明,封片。采用Image J 统计数据进行分析。

1.4 统计学方法

应用SPSS 25.0 软件进行数据统计分析,计量资料结果用平均数±标准差()示,将测定数据进行正态性、方差齐性检验,组间比较采用t检验,多样本均数比较采用单因素方差分析,P＜0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠扭体反应及潜伏期检测

与正常组相比较,模型组30 min 内小鼠扭体反应次数显著增多(P＜0.01),潜伏期显著缩短(P＜0.01)。与模型组比较,阳性药组30 min 扭体次数增加(P＜0.05)四物合剂组30 min 内扭体次数显著减少,潜伏期明显增加(P＜0.01,P＜0.05),见表1。

表1 各组原发性痛经小鼠模型潜伏期、扭体次数(,n=15)Table 1 Comparison of latency and body twisting times of primary dysmenorrhea model mice in each group

表1 各组原发性痛经小鼠模型潜伏期、扭体次数(,n=15)Table 1 Comparison of latency and body twisting times of primary dysmenorrhea model mice in each group

注:与正常组比较,##P＜0.01；与模型组比较,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the normal group,##P＜0.01.Compared with the model group,*P＜0.05,**P＜0.01.

2.2 小鼠血清SOD、MDA 含量测定

与正常组相比,模型组、阳性药组、四物合剂组小鼠血清中SOD 无显著性差异；与正常组相比,模型组血清MDA 显著增加(P＜0.01)；与模型组相比,阳性药组、四物合剂组血清MDA 显著降低(P＜0.01),见表2。

表2 各组原发性痛经模型小鼠血清SOD、MDA(,n=15)Table 2 Serum SOD and MDA of primary dysmenorrhea model mice in each group

表2 各组原发性痛经模型小鼠血清SOD、MDA(,n=15)Table 2 Serum SOD and MDA of primary dysmenorrhea model mice in each group

注:与正常组比较,##P＜0.01；与模型组比较,**P＜0.01。Note.Compared with the normal group,##P＜0.01.Compared with the model group,**P＜0.01.

2.3 小鼠子宫匀浆PGF2α、IL-6、TNF-α 测定

与正常组相比,模型组子宫组织中PGF2α显著增高(P＜0.01)；与模型组相比,阳性药组PGF2α显著降 低(P＜0.01),四物合剂组PGF2α降低(P＜0.05)；与正常组相比,模型组子宫组织IL-6、TNFα 增加(P＜0.05),与模型组相比,阳性药组、四物合剂组子宫组织IL-6、TNF-α 降低(P＜0.05),见表3。

表3 各组原发性痛经模型小鼠子宫组织PGF2α、IL-6、TNF-α(,n=15)Table 3 Uterine tissue of primary dysmenorrhea model mice in each group PGF2α,IL-6,TNF-α

表3 各组原发性痛经模型小鼠子宫组织PGF2α、IL-6、TNF-α(,n=15)Table 3 Uterine tissue of primary dysmenorrhea model mice in each group PGF2α,IL-6,TNF-α

注:与正常组比较,#P＜0.05,##P＜0.01；与模型组比较,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the normal group,#P＜0.05,##P＜0.01.Compared with the model group,*P＜0.05,**P＜0.01.

2.4 小鼠子宫组织病理观察

小鼠子宫组织病理分析见图1。正常组小鼠子宫腺体多,腔大饱满,间质疏密均匀,血管丰富,内膜上皮固有层结构紧密,间质细胞丰富,未见明显异常。

图1 原发性痛经模型小鼠HE 染色切片Note.A,Normal group.B,Model group.C,Positive drug group.D,Siwu mixture group.Figure 1 HE staining sections of primary dysmenorrhea model mice

模型组子宫内膜腺体扩张,呈乳头状增生,间质水肿血管扩张,炎性细胞浸润,说明模型制备成功。与模型组相比,阳性药组小鼠子宫水肿和炎性细胞浸润明显减轻,四物合剂组小鼠子宫腺腔见少量炎症细胞浸润。

2.5 小鼠子宫组织COX-2 表达

与正常组相比,模型组子宫组织COX-2 表达增加(P＜0.05)；与模型组相比,阳性药组、四物合剂组子宫组织COX-2 表达降低(P＜0.05),见图2、图3。

图2 原发性痛经模型小鼠COX-2 免疫组化切片Note.A,Normal group.B,Model group.C,Positive drug group.D,Siwu mixture group.Figure 2 COX-2 immunohistochemical section of primary dysmenorrhea model mice

图3 COX-2 在小鼠子宫组织中的表达Note.A,Normal group.B,Model group.C,Positive drug group.D,Siwu mixture group.Compared with the normal group,##P＜0.01.Compared with the model group,**P＜0.01Figure 3 Expression of COX-2 in mice uterus

3 讨论

原发性痛经病位在子宫,变化在气血主要病机为“不荣则痛、不通则痛”[4]。清代《傅青主女科》的“舒则通畅,郁则不扬,经欲行而肝不应,则抑拂其气而疼生”进一步阐明原发性痛经形成原因为体虚、寒、气郁、血结等。四物合剂组成成分为:当归、熟地黄、白芍、川芎,具有益气活血、补血养血功效,为临床治疗原发性痛经常用药物。

缩宫素诱发的小鼠原发性痛经模型是被广泛认可的痛经药效学实验模型,常应用于原发性痛经的研究[11]。原发性痛经的主要临床症状是剧烈的急性腹痛,因此采用扭体反应为主要指标用来评价实验药物的疗效[12-13]。本研究发现,与正常组相比,模型组小鼠30 min 内扭体次数显著增加,潜伏期缩短,阳性药组、四物合剂组有效降低了PD 模型小鼠30 min 内扭体反应次数,延长疼痛潜伏期,说明四物合剂可拮抗缩宫素诱发的小鼠急性腹痛。

现代研究发现,原发性痛经与子宫内膜平滑肌阵发性收缩所导致的肌间血管受压而引起的子宫肌层及内膜暂时性缺血,产生过多自由基有关[14]。MDA 是脂质过氧化代谢的重要产物,可引起细胞损伤,其含量可间接反映子宫细胞受自由基损伤的严重程度[15]。研究发现,与正常组相比,模型组小鼠血清MDA 水平显著增加,阳性药组、四物合剂组血清MDA 水平较模型组降低说明四物合剂组小鼠子宫组织内脂质过氧化程度低,提示四物合剂在一定程度上减少子宫氧化应激水平。

子宫内膜是合成前列腺素的重要部位,研究表明,PD 的病因是子宫前列腺素(PGs)的过多分泌使子宫过度收缩[5],前列腺素的生物合成在疼痛模型的疼痛机制中有重要作用[16]。特别是PGF2α刺激子宫收缩、缺血,导致月经痛[5]。与正常组相比,模型组小鼠子宫组织中的PGF2α水平显著增高,阳性药组、四物合剂组小鼠子宫组织PGF2α水平较模型组降低。炎症与痛经息息相关,研究发现原发性痛经的主要机制与前列腺素、白细胞介素的增高密切相关[17]。TNF-α 具有调控免疫应答、促进细胞生长分化等多种生物学功能,参与了多种炎症反应和神经相关慢性疼痛[17]。白介素6 是一种多效性细胞因子,在免疫调节、再生过程、骨稳态调节、心血管系统保护等方面发挥多种生物学作用[18]。研究表明子宫内膜异位症患者血清TNF-α、IL-6 水平显著升高且严重痛经患者较无痛经患者血清TNF-α、IL-6 显著升高[19]。本研究中,模型组子宫组织TNF-α、IL-6 含量增高,阳性药组、四物合剂组子宫组织TNF-α、IL-6 含量降低,表明四物合剂可能通过降低TNF-α、IL-6 减轻痛经症状。

环氧化酶(COX)是参与PGs 的生物合成限速酶,临床常用非甾体类抗炎药治疗原发性痛经,其机制主要是通过抑制COX 减少PGs 的生成,COX-2高表达使PGF2α升高加重痛经[20]。本研究表明,四物合剂可降低COX-2 表达,其治疗痛经机制可能与降低COX-2 表达从而抑制PGF2α治疗小鼠原发性痛经有关。

综上所述,四物合剂能显著减少原发性痛经小鼠30 min 扭体次数,延长扭体潜伏期,其作用机制可能与降低血清MDA 含量、子宫组织中PGF2α、IL-6、TNF-α 水平以及COX-2 表达,改善组织病理学变化有关,其机制值得进一步深入研究。