桃红四物汤治疗骨质疏松性骨折的网络药理学和分子对接研究

白万辉 赵勇 王旋 陈泓颖 韦俊余 秦伟凯

1.北京中医药大学，北京 100029 2.中国中医科学院望京医院，北京 100102

骨质疏松性骨折(osteoporosis fracture，OF)多是原发性骨质疏松患者首次就诊的原因，亦是骨质疏松症最严重的后果，危险因素包括种族、性别、老龄化、脆性骨折家族史等[1]。骨折部位常见于脊柱、髋部、桡骨远端等部位。其治疗遵循复位、固定、功能锻炼和抗骨质疏松的原则，中药被认为对骨折愈合及预防再发骨折具有积极意义[2]。

《景岳全书》指出其属“骨折病”范畴，肾虚血瘀是重要病机之一[3-4]，桃红四物汤是中医骨伤科常用方剂，临床多加味使用治疗该病。现代药理学证实其中药物具有活血化瘀、镇痛、促进骨折愈合、抗炎、提高免疫力等作用[5-6]。相关临床试验表明其对OF急性期消肿止痛及促进骨折愈合显示出良好疗效[7-9]，但相关作用机制尚不十分明确。

本研究使用网络药理学筛选方药中主要活性成分及其潜在作用靶点，并通过分子对接技术验证有效成分与作用靶点之间活性，意在发掘桃红四物汤治疗OF潜在活性成分及作用机制。

1 资料与方法

1.1 药物主要活性成分和潜在靶点

通过中药系统药理学分析平台TCMSP，收集熟地黄、白芍、当归、川芎、桃仁、红花的化学成分，构建数据库，利用生物利用度(OB≥30%)和类药性指数(DL≥0.18)筛选，选择不同药物的主要活性成分及潜在靶点，靶点通过UniProt数据库转换为人类相应标准基因。

1.2 疾病靶点筛选

以“Osteoporosis fracture”或“Fragility fracture”或“Osteoporotic fracture”为检索词分别根据数据库特性进行检索：GeneCards数据库、OMIM 数据库、DrugBank数据库、DisGeNET数据库，删除重复靶点，最终确定OF疾病靶点。

1.3 构建“药物-成分-靶点-疾病”可视化网络图

使用venny2.1软件将桃红四物汤有效成分的靶点与OF疾病靶点取交集，得到的共有靶点同有效成分、疾病、药物为网络中的节点(node)，四者之间的相互作用为网络中的连接(edge)，制成表格，并通过 Cytoscape 3.8.2软件构建。

1.4 交集靶点的蛋白互作网络

将1.3交集靶点上传STRING 11.0数据库，选择物种为homo sapiens，获得相关信息，导入Cytoscape软件中利用工具cutoHubba，构建蛋白相互网络(PPI)，分析各靶点之间的作用关系，并结合可视化网络图筛选出核心靶点。

1.5 基因本体论(GO)及KEGG通路富集分析

Metascape数据库导入交集靶点，选择物种为homo sapiens，获取具有显著性的富集信息(P<0.05)，其中GO及KEGG富集分析结果各选取P值最小的20条，将相关信息(富集名称、P值、Count)运用在线工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)分别进行GO及KEGG富集气泡图绘制。

1.6 分子对接

1.3中degree值前3活性成分作为配体、1.4中degree前3靶蛋白作为受体，从PDB数据库中获取靶蛋白3 D结构，用Pymol2.4.1进行预处理。Pubchem数据库获取有效成分的sdf结构，通过OpenBabel转换成mol2文件。通过Autodock Tools1.5.6软件将受体和配体分别进行处理，AutoDock Vina计算结合能，最终通过Pymol可视化数据。

2 结果

2.1 药物主要活性成分和潜在靶点

桃红四物汤中熟地黄(2)、白芍(13)、当归(2)、川芎(7)、桃仁(23)、红花(22)药物有效成分69个，将筛重后44个有效成分编码Id(表1)；通过UniProt转化得到的标准基因靶点代码(Symbol)，筛重后得到潜在靶点229个。

表1 桃红四物汤主要活性成分信息Table 1 Information on the main active ingredients of Taohong Siwu decoction

2.2 桃红四物汤与OF共有靶点

获得疾病相关靶点3 752个，筛重后剩余3 639个，与桃红四物汤有效成分潜在靶点，使用Venny2.1软件取交集，得到共有靶点152个，见图1。

图1 桃红四物汤活性成分靶点和OF靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of active component target in Taohong Siwu decoction and disease target in OF

2.3 “药物-成分-靶点-疾病”可视化网络图

网络图共包括203个节点，535条相互作用关系，见图2。不同颜色和形状的节点代表信息不同，其中红色三角节点代表疾病，绿色圆形节点代表中药，墨绿色菱形代表共有靶点，各色八边形代表不同的有效成分，V形代表相同有效成分，连线代表四者之间的相互作用关系。根据degree值显示node大小，越大表示在网络中连接程度越高。根据degree值筛选出前10的关键活性成分，见表2。

图2 桃红四物汤“药物-有效成分-靶点-疾病”网络图Fig.2 The network of drug-active ingredients-target-disease of Taohong Siwu decoction

表2 药物-有效成分-靶点-疾病网络图有效成分及PPI靶点蛋白(Degree前10)

2.4 交集靶点的蛋白互作网络

将共有靶点152个上传STRING数据库获取蛋白之间的作用关系，构建蛋白相互网络(PPI)(图3)，根据degree值分析出前10核心靶点，见表2。

图3 桃红四物汤治疗OF蛋白互作网络图Fig.3 Protein-protein interaction network regarding Taohong Siwu decoction in the treatment of OF

2.5 基因本体论(GO)及KEGG通路富集分析

GO富集分析获得生物过程(BP)5 881个、细胞组成(CC)和分子功能(MF)分别为503和465个，共6 849个条目(P<0.01)。从生物过程的相关条目分析，桃红四物汤治疗骨质疏松性骨折的靶点主要参与对无机物及激素、伤害应激、细胞凋亡增殖、生长因子等过程；细胞组成方面，治疗靶点主要覆盖细胞膜阀、囊泡腔、转录因子复合体、蛋白激酶复合物等区域；分子功能相关条目主要针对转录因子结合、核受体活性、蛋白激酶结合等过程。每个模块分别根据P值排序前20位(图4)。KEGG通路富集分析共得到465条信号通路，筛选排名前20条条目(图5)。主要涉及癌症途径、糖尿病并发症中的AGE-RAGE、乙肝、IL17、PI3K-Ak、HIF-1、多种激素、钙等多种信号通路，与炎症反应、骨代谢、血管生成和免疫调节密切相关。

图4 GO富集分析(排名前20)Fig.4 GO enrichment analysis (top 20)

图5 KEGG 信号通路分析 (排名前20)Fig.5 KEGG channel analysis (top 20)

2.6 分子对接验证

关键活性成分与靶蛋白的分子对接稳定，两者具有较好的结合活性(表3)。以槲皮素和AKT1蛋白结构对接模式为例，槲皮素能稳定地对接到AKT1蛋白结构活性口袋中，说明槲皮素与AKT1具有良好的结合作用，见图6。

表3 活性成分与核心靶点蛋白的结合能(kJ/mol)

图6 槲皮素与AKT1的分子对接模式图Fig.6 Molecular docking picture of quercetin and AKT1

3 讨论

本研究结果显示，桃红四物汤含有多种有效成分如槲皮素、木犀草素、山奈酚、多种甾醇、黄芩素等均是网络中的重要节点，它们多属于桃仁、红花，体现了君药在方剂中的决定性作用。结合相关的基础与临床研究，这些成分具有解热镇痛抗炎、调控细胞增殖分化、改善骨代谢、抗肿瘤及免疫调节等作用[10-13]，在OF治疗中扮演着重要的角色。

从蛋白相互网络和可视化网络图的结果来看，IL6、JUN、AKT1、MAPK1、TNF等可能是桃红四物汤治疗OF的关键靶点，这也体现了桃红四物汤治疗OF具有多靶点的特点。有研究表明[14-15]，IL-6可作用于破骨细胞的早期阶段，刺激破骨细胞前体细胞分裂增殖，影响成骨细胞活性，同时使成骨细胞通过胞间接触，产生具有前列腺素、IL1、集落刺激因子等的微环境，并使得破骨细胞发挥骨吸收的作用，研究证实绝经后雌激素水平降低导致IL6产生过量，二者表现出负相关。JUN属于AP-1转录因子家族，主要参与细胞增殖、免疫相关、凋亡抑制等信号通路，有研究表明[16]，JUN通过Wnt通路参与成骨细胞的形成，使得骨质增加，骨长度变短。AKT1是PI3K/AKT信号通路中核心因子，主要通过调控细胞增殖和生长，参与包括细胞凋亡和葡萄糖代谢在内的细胞过程[17]。MAPK1属于整合多个生化信号，参与如转录调控、增殖分化及发育等复杂的细胞过程[18]。破骨细胞样细胞及成骨细胞合成TNF，已证明的TNFα可以直接对成骨细胞的增殖、分化产生影响，从而抑制胶原合成、AKP活性和骨钙素合成[19]。由此可知，桃红四物汤可通过参与细胞免疫反应、骨细胞增殖分化、细胞代谢、炎症反应等治疗OF。

富集分析发现桃红四物汤治疗OF多作用于RANKL-RANK启动的下游信号通路，如PI3K/Akt、NF-κB、MAPK信号通路等[20-21]，OPG/RANKL/RANK系统具有重要的信号转导作用[22]，在介导破骨细胞分化和功能的过程中，起到抗骨质疏松的作用[23]。肿瘤、糖尿病、甲状腺激素信号通路可能与继发性OF密切相关，本研究重点介绍桃红四物汤活性成分起到抗炎免疫、细胞修复、调节骨细胞等的作用通路。IL17家族通过相应受体信号并激活下游信号通路如NF-KappaB、MAPKs和C/EBPs，诱导多种具有抗炎及修复功能的因子表达，从而将髓样细胞吸引到炎症部位[24]。NF-kappaB属于NF-κb/Rel家族，是一种重要的转录因子，RANKL的信号经RANK传递给TRAF6，TRAF6通过NIK(NF-κB可诱导性激酶)和IKK(NF-κB激酶诱导剂)活化NF-κB，与Ⅰ-KB分离后的NF-κB迅速进入细胞核，并和相应启动子结合，以通过调控转录来调节破骨细胞的分化、功能和凋亡[25]。IL17A在骨髓中广泛表达，其受体编码蛋白还调节NF-κB和丝裂原激活的蛋白激酶的活性，并可以诱导炎症信号如IL6和环氧合酶2(PTGS2/COX-2)的过表达，并有效增加一氧化氮(NO)的含量，对宿主防御反应、细胞转运、免疫调控和组织修复重建具有重要影响，是炎性及多种疾病的关键环节[24]。本研究发现低氧诱导因子-1(HIF-1)通过调控多种蛋白因子和多个经典信号通路，起到促进细胞增殖分化；此外，HIF-1高表达可以促进长骨成骨[26]。桃红四物汤治疗OF是从多信号通路出发的，且通路之间存在紧密联系。其他相关通路目前报道较少，还需要深入研究，以证实其作用机制。

综上所述，桃红四物汤从多靶点、多成分及多通路出发治疗骨质疏松性骨折，证明中医药对本病的治疗具有天然优势。本研究为骨质疏松及其合并症的治疗提供了循证证据，也为今后深入揭示其核心靶点作用机制奠定了基础，对抗骨质疏松新药的研发同样具有意义。