非共价键法构筑C60-Py-GO 用于光热和光动力疗法

张美多，李德华，刘鸣禹

吉林警察学院刑事科学技术系，吉林 长春130117

0 引 言

癌症已逐渐成为危害人类生命健康的重要问题之一。纳米技术及生物医学的进步，使得纳米功能材料在癌症治疗中受到越来越多的关注。光热疗法（photothermal therapy，PTT）和 光 动力疗法(photodynamic therapy，PDT)具有微创、低毒，收效快、选择性高，重复应用不会产生耐药性、不破坏正常组织,并可与其他治疗方法联合应用等优点，已成为癌症治疗研究领域的热点之一[1]。光热疗法主要利用光热剂将光能转化为热能，然后依靠热量消融肿瘤而不损害正常组织。光热剂主要包括无机纳米材料类和有机纳米材料类[2～5]。与光热疗法不同，光动力疗法主要使用具有光活化作用的光敏剂，将吸收的能量转移到邻近分子氧上产生活性氧物质（ROS），尤其是具有细胞毒性的单线态氧（1O2）。在光激发下，1O2可对患病细胞和肿瘤组织造成不可逆破坏[6，7]。与单一光疗技术相比，将两种光疗技术相结合可体现出协同作用，并提高治疗准确性和治疗效率[8～10]。

近年来，具有近红外光吸收性质和良好机械性能的氧化石墨烯（GO）引起了人们极大的研究兴趣[11，12]。GO 具有单原子厚度和较大的π 共轭体系，可以用作分子组装或π 电子体系多功能纳米平台，应用于体外和体内光热治疗。然而，GO 可能会抑制1O2的产生，进而阻碍GO 在光动力治疗中的应用[13]。因此，构建一种基于GO 而不影响1O2生成的纳米体系对于肿瘤治疗有重要的研究意义。

富勒烯（C60）是碳的同素异形体，因具有低毒性、高比表面积、易表面功能化和较高的1O2产率而被广泛应用于光动力疗法[14]。Hu 等[15]利用聚多巴胺（PDA）包裹GO 形成PDA-rGO，再借助Schiff 碱反应/ Michael 加成反应，以共价键方式引入叶酸-C60衍生物构筑C60-PDA-rGO 纳米杂化物，该体系表现出光动力和光热协同治疗癌细胞的作用。然而，该纳米杂化物中的C60和GO 均存在水溶性较差等缺点。为了解决水溶性问题，Li 等[16]经过多步反应在GO 表面接枝聚乙二醇（PEG），再接枝乙二胺，暴露出氨基，然后将C60衍生物与裸露氨基结合构成水溶性的GO-C60纳米杂化体系，该体系展现出一定的光热和光动力治疗效果。但上述水溶性GO-C60纳米杂化体系的制备过程较繁复，且共价键修饰的GO 会破坏石墨烯原始的共轭结构，并对其性质产生不利影响。非共价键结合法可有效避免上述问题[17]。芘（pyrene，Py）的多环芳香化合物结构是一种常用的非共价键连接基团，可与GO 发生π-π 非共价键相互作用，实现GO 表面功能化。此外，非共价键结合法还可以有效维持GO 表面碳原子sp2杂化固有的电子结构[18，19]。

本 研 究借助C60-Py 与PEG-GO 之 间的π-π 相互作用，以非共价键构筑水溶性C60-Py-GO 纳米体系，并探讨了该体系对癌细胞的光热和光动力联合治疗效果。图1 为C60-Py-GO 的合成和光热效应、光动力效应示意图。

图1 C60-Py-GO 的合成和光热效应、光动力效应示意图Fig.1 The synthesis, PTT and PDT of C60-Py-GO

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

试剂：C60（分析纯，苏州大德碳材料有限公司）；碘（分析纯）、H2SO4（分析纯）、高锰酸钾、H2O2溶液（北京化工厂）；人宫颈癌HeLa 细胞株（上海中科院细胞库）；聚乙二醇2000（PEG-2000）、1-芘丁酸、丙二酰二氯、吡啶、LiAlH4（安耐吉化学）；磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7. 4，赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司）；其他化学试剂均为化学纯或分析纯试剂，无需纯化直接使用；合成过程使用的溶剂通过蒸馏纯化；实验用水为去离子水。

仪器：PL-X500D 氙灯（配置300～700 nm 滤光片，北京普林塞斯科技有限公司）；MW-GX-808/1-5000 mW 激光器（长春镭仕光电科技有限公司）；Win-IR 型傅里叶红外光谱仪（FT-IR，BIO-Rad 公司）；NanoBrook 90Plus 动 态 光 散 射 仪（DLS，Brookhaven 公司）；Perkin-Elmer-TGA 热分析系统（TGA，Perkin-Elmer 公司）；Avance 400 MHz 型磁共振仪（1H NMR、13C NMR，Bruker 公司）；AutoflexⅢTOF/TOF 型质谱仪（HR-MS，Bruker 公司）；UV-3600 型分光光度计（UV-Vis，Shimadzu 公司）；SPI 3800N 型探针台（AFM，Seiko 公 司）；JEM-1011 型透射电子显微镜（TEM，JEOL 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 C60-Py 的制备

化合物C60-Py 的合成路线如图2 所示。

图2 C60-Py 的合成路线Fig.2 Synthesis route of C60-Py

化合物1的合成：氮气保护下，将LiAlH4的无水四氢呋喃（THF，2.50 g，65 mmol）溶液滴加到冰浴冷却的1-芘丁酸（2.00 g，6.9 mmol）的无水THF（100 mL）溶液中，滴毕，回流反应过夜。用水淬灭反应，用二氯甲烷萃取，取有机相经Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩，残余物经硅胶色谱柱（石油醚/乙酸乙酯体积比：10/1）纯化得淡绿色固体（化合物1），产率95.2%；磁共振氢谱（1H NMR，CDCl3，400 MHz）化学位移值δ：8.27（d，J=10.8 Hz，1H），8.17（d，J=2.4 Hz，1H），8.15（d，J=2.4 Hz，1H），8.11～8.09（m，2H），8.02～7.96（m，3H），7.87（d，J=9.6 Hz，1H），3.73～3.68（m，2H），3.40～3.35（m，2H），1.99～1.90（m，2H），1.79～1.71（m，2H），1.34（s，1H）；磁共振碳谱（13C NMR，CDCl3，100 MHz）δ: 136.58，131.35，130.83，129.71，128.52，127.44，127.13，126.50，125.72，125.00，124.95，124.77，124.70，124.61，123.30，62.42，33.11，32.45，27.84。

化 合 物2的 合 成：将 化 合 物1（1.00 g，3.6 mmol）、丙 二 酰 二 氯（0.291 g，2.0 mmol）和 吡 啶（0.537 g，6.8 mmol）溶于20 mL CH2Cl2中，氮气保护下回流反应过夜。冷却至室温，用水淬灭反应，将反应液倒入0.5 mol/L 盐酸中，用二氯甲烷萃取，取有机相依次用饱和Na2CO3溶液和去离子水洗涤，用Na2SO4干燥后经硅胶柱色谱（二氯甲烷/乙酸乙酯体积比：49/1）分离得到白色化合物2,产率36.4%;1H NMR (CDCl3，400 MHz)δ：8.16 (d，J=9.2 Hz，2H)，8.14～8.11(m，4H)，8.07(d，J=2.0 Hz，2H)，8.02(s，2H)，7.98～7.93(m，6H)，7.75(d，J=7.6 Hz，2H)，4.14(t，J=12.8 Hz，4H)，3.36 (s，2H)，3.26 (t，J=15.2 Hz，4H),1.84 (m，4H)，1.74(m，4H);13C NMR (CDCl3，100 MHz)δ：166.62，135.92，131.45，130.56，129.59，128.43，127.45，127.26，127.12，126.30，125.79，124.87，124.75，124.43，123.02，65.10，41.79，32.56，28.31，27.90。

化 合 物C60-Py 的 制 备：将C60（0.108 g，0.15 mmol）、化合物2（0.103 g，0.17 mmol）、I2（0.093 0 g，0.37 mmol）和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯（DBU，0.154 g，1.01 mmol）溶于30 mL 无水甲苯中，氮气保护下于室温搅拌反应12 h，反应液冷却至0 ℃，倒入去离子水中，用二氯甲烷萃取，取有机相经硅胶柱层析（甲苯/石油醚体积比：10/1）纯化得C60-Py，产率56.3%；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ: 8.16(d,J=9.6 Hz,2H),8.09(d,J=7.6 Hz,4H),8.03(d,J=8.4 Hz,4H),7.96(s,4H),7.93～7.91(m,2H),7.74(d,J=8 Hz,2H),4.43(m,4H),3.28(m,4H),1.85(m,8H);13C NMR (CDCl3,100 MHz)δ:163.89,144.99,144.68,144.49,144.27,143.56,143.05,142.66,141.83,141.53,140.58,138.74,137.82,136.02,131.46,130.84,129.96,128.56,127.40,127.12,126.82,126.20,127.91,124.81,66.70, 32.51, 29.77, 28.41; HR-MS(EI)m/z:C103H34O4理论值1 334.346 9，实验值1 334.230 4;元素分析C103H34O4: 理论值C 92.6、H 2.55，实验室C 83.23、H 2.46。

1.2.2 PEG-GO 的合成

根据文献方法合成PEG-GO[20]。冰浴条件下，将3.00 g 石墨薄片和400 mL 浓H2SO4在1 L 圆底烧瓶中搅拌10 min，缓慢加入3.00 g KMnO4（约30 min），混合液立即变为深绿色。每间隔24 h 向混合液中加入3.00 g KMnO4，共加3 次，待反应结束后，取120 mL（约180 g）反应液倒入300 mL 冰水中，缓慢加入2 mL H2O2，溶液由深紫色变为黄色，以4 400 r/min 离心10 min，用去离子水清洗，再用异丙醇纯化直至溶液pH 值为中性。使用MwCO 透析管(3 500)在异丙醇中透析3 d,以10 000 r/min 离心30 min，收集固体成分，减压蒸发去除异丙醇得GO（1.12 g）。将100 mL GO（3.33 mg/mL 的水溶液）超声处理10 min，加入2.00 g PEG 2000，于120 ℃加热搅拌24 h，制得PEG-GO。

1.2.3 C60-Py-GO 的制备

将50 mL PEG-GO（2.67 mg/mL 的水溶液）与10 mL C60-Py（2.00 mg/mL 的甲苯溶液）混合，超声40 min 至混合均匀，再于60 ℃剧烈搅拌除去甲苯得到C60-Py-GO 水溶液。在进行细胞实验前，将C60-Py-GO 放入透析袋中透析，每6 h 换水一次，透析2 d。

1.2.4 光热处理

在96 孔板内，将Hela 细胞以每孔1.00×104个的密度种在200 μL 的DEME 培养基中，在37 ℃，5% CO2条件下培养24 h。吸出培养基并用PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）将细胞清洗3 次，再加入180 μL 新 鲜培养 基 和20 μL 不 同 浓 度的C60-Py-GO 溶液，确保不同孔内C60-Py-GO 的浓度呈梯度分布。分别用808 nm 激光（1～3 W）、可见光（300～700 nm可见光）以及双光源照射细胞5 min，用噻唑蓝（MTT）法测定细胞存活率，考察C60-Py-GO 的光热/光动力治疗效果。

2 结果与讨论

2.1 C60-Py-GO 的表征

图3 为各样品的透射电镜（TEM）图和原子力显微镜（AFM）图。通过TEM 图片可以看出，C60-Py-GO（图3(a)）中在薄片板上分布有较均匀的纳米簇点，和文献［16］中C60-GO 的TEM 图的特征形态一致；GO（图3(b)）和PEG-GO（图3(c)）呈现有褶皱的薄片状且没有团簇点，而C60-Py 图3(d)呈现较明显的团聚形貌。通过AFM 图片可以看出，C60-Py-GO（图3(e)）和PEG-GO（图3(g)）的边界较模糊，而GO（图3(f)）边界较为清晰，与文献[21]中PEG-GO的AFM 图形貌相近，因此推测这种现象是PEG 对GO 表面包裹造成的。

图3 (a)C60-Py-GO、(b)GO、(c)PEG-GO 和(d)C60-Py 的TEM 图；(e)C60-Py-GO、(f)GO 和(g)PEG-GO 的AFM 图Fig.3 The TEM images of (a)C60-Py-GO, (b)GO, (c)PEG-GO and (d)C60-Py;the AFM images of(e)C60-Py-GO, (f)GO and (g)PEG-GO

图4(a)为各样品水溶液的动态光散射图。对比3 个体系粒径分布曲线的峰值，GO 峰值粒径为345 nm，PEG-GO 峰值粒径为225 nm，C60-Py-GO峰值粒径为170 nm。PEG-GO 体系的粒径明显小于GO 的 原 因 主 要 是，GO 经PEG 修 饰 后，PEG 对GO 片层间的范德华力和氢键的弱化作用有利于GO 片层的剥离与延展以及阻止GO 的聚集，从而增 强 了 其 分 散 性[22，23]。而 与PEG-GO 相 比，C60-Py-GO 粒径更小，可能与此体系在合成过程中经过了更长时间的超声振荡，增强了其在水中的分散性有关。此外，通过图4(b) C60-Py-GO 水溶液放置7 d 前后的照片可以看出，该体系在放置7 d 后分散性良好，未出现明显的团聚现象，表现出较好的稳定性。

图4 (a)GO、PEG-GO 和C60-Py-GO 的动态光散射图；(b)C60-Py-GO 体系的分散状态照片Fig.4 (a)The dynamic laser scaterring of GO, PEG-GO and C60-Py-GO;(b)photographs for the dispersion status of C60-Py-GO

图5(a)为GO, PEG-GO,C60-Py 和C60-Py-GO的红外光谱图（FT-IR）。GO 的谱图中，O—H、C=O 和C=C 的特征吸收峰分别位于3 400、1 733、1 620 cm-1处。与GO 相比，PEG-GO 在2 900 cm-1处出现了一个新的吸收峰，归属为PEG 中—CH2—的振动峰，该峰的出现表明PEG-GO 合成成功[24]。C60-Py-GO 谱图中除具有PEG-GO 的特征峰外，在527 cm-1和1 424 cm-1两处还出现了C60的典型特征峰[15]。综合上述分析可知，C60-Py 和PEG-GO 形成了C60-Py-GO 结构体。图5(b)为GO 和C60-Py-GO 的紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱。C60-Py-GO谱图在220 nm 处的吸收峰为GO 的特征吸收峰，在图5(b)的插图中可以观察到在270 nm 和350 nm 处的两个弱吸收峰，来源于水溶性较差的C60-Py[25，26]。上述实验结果也证实了C60-Py-GO 制备成功。

图5 (a)GO, PEG-GO,C60-Py 和C60-Py-GO 的FT-IR 谱 图；(b)GO 和C60-Py-GO 的UV-Vis 吸 收 光 谱Fig.5 (a)FT-IR spectra of GO, PEG-GO, C60-Py and C60-Py-GO;(b)the UV-Vis absorption spectra of GO and C60-Py-GO

图6 为各样品的热重分析曲线（TGA）。其中GO 在低于100 ℃的热失重归因于水分的蒸发，160 ℃处显著的热失重归因于GO 表面含氧官能团的热分解[27]。PEG-GO 中200 ℃附近的热失重归因为GO，250～420 ℃阶段的热失重为PEG[28]。因C60在700 ℃下几乎不分解[29]，故C60-Py 在200～400 ℃间的热失重归因于Py 基团[30]。C60-Py-GO 的TGA曲线与PEG-GO 相似，可以证实此体系中GO 和PEG 的存在，但在200～400 ℃间C60-Py-GO 的失重率比PEG-GO 多出2.91%，是由体系中少量Py 基团的失重所导致，因此说明此体系中含有Py 基团。以上结果进一步证实C60-Py-GO 制备成功。

图6 GO,C60-Py, PEG-GO, C60-Py-GO 的TGA 曲 线Fig.6 The TGA of GO, C60-Py, PEG-GO,and C60-Py-GO

2.2 C60-Py-GO 的光热/光动力效应

2.2.1 光热效应

图7(a)(b)为C60-Py-GO 浓度和激光功率对C60-Py-GO 溶液光热效应的影响。通过图7(a)可以看出，使用功率为2 W 的808 nm 激光照射纯水10 min后，水的温度从27 ℃升高至31 ℃，未发生显著性变化；而使用功率为2 W 的808 nm 激光照射C60-Py-GO 溶液10 min 后，C60-Py-GO 溶液升温效果明显，且随着C60-Py-GO 浓度的增加升温效果更加显著，尤其是3.00 mg/mL 体系的温度从27 ℃升高至51 ℃。通过图7(b)可以看出，C60-Py-GO 溶液的升温效果随着激光功率的增加更加显著，当激光功率为3 W 时，C60-Py-GO 溶液（3.00 mg/mL）的温度甚至可升高至59 ℃。上述实验现象表明，单位体积的C60-Py-GO 溶液可以吸收更多光能并将其转化为更多的热能，显著升高体系的温度。这一性能使其有望作为光热剂用于癌症的治疗。

图7 溶液浓度(a)和激光强度(b)对C60-Py-GO 光热效应的影响Fig.7 Effects of concentration (a)and laser intensity (b)on the photothermal effect of C60-Py-GO

通过（1）式和（2）式计算C60-Py-GO 纳米体系的光热转换效率[31]。

其中，η（%）代表光热转换效率，h（W/（m2·℃））为热传导系数，S(m2)为样品池表面积，ΔTmax,mix(℃)为溶液体系平衡温度与环境温度的差值（24 ℃），ΔTmax,H2O(℃)为纯水的平衡温度与环境温度的差值（4 ℃）,I(W)为激光功率（2 W）,A808nm为C60-Py-GO在808 nm 处的吸光度（0.32）,mi（g）为样品质量（1 g），Cp,i(J/g)为水的比热容（4.2 J/g），τs(s)为采样系统时间常数。

图8(a)为C60-Py-GO 在(808 nm，2 W)激光照射及停止照射的光热响应曲线，将图8(a)中的降温时间与驱动力温度负对数（-lnθ）作图得到图8(b)，通过图8(b)可得τs=212 s。将τs代入（2）式计算hS=0.019 8 W/oC，再将hS代入（1）式计算出C60-Py-GO 光热转换效率η为37.9%。

图8 (a)C60-Py-GO 在激光(808 nm, 2 W)照射及停止照射的光热响应曲线；(b)降温时间与驱动力温度负对数曲线Fig.8 (a)The photothermal response of C60-Py-GO with a laser (808 nm, 2 W)and then the laser shut off;(b)plot of cooling period versus negative natural logarithm of driving force temperature

2.2.2 光动力效应

可见光照射C60后产生的1O2可以有效降低4-亚硝基-N，N′-二甲基苯胺（RNO）在440 nm 处产生的吸光度[13]，因此选用RNO 作为生成1O2的指示剂，以RNO 在440 nm 处的吸光度指示1O2的浓度。图9为GO、PEG-GO、C60-Py-GO 随着光照时间变化产生1O2的情况。可以看出，C60-Py-GO 经过可见光照射30 min，在440 nm 处的吸光度为0.718，呈现出明显的下降趋势，而GO 和PEG-GO 在相同条件下吸光度未发生明显变化，表明C60-Py-GO 经过可见光照射后生成了1O2。此前曾有GO 抑制1O2生成的报道[32，33]，但本文结果表明，采用非共价键结合方式构建的C60-Py-GO 纳米体系能够有效生成1O2。

图9 GO, PEG-GO 和C60-Py-GO 随着光照时间变化产生1O2的情况Fig.9 The1O2production by GO, PEG-GO and C60-Py-GO after irradiation for different time periods

2.3 C60-Py-GO 的光热/光动力治疗效果

采用MTT 法检测了C60-Py-GO 体系对Hela细胞的光热/光动力治疗效果。如图10(a)所示，在无光源照射时，C60-Py-GO 体系对Hela 细胞无明显毒性，表明C60-Py-GO 体系具有良好的生物相容性。当在808 nm 激光照射下，C60-Py-GO 体系（140 μg/mL）利用其光热效应可使Hela 细胞存活率降至27.6%；当在可见光照射时，C60-Py-GO 体系（140 μg/mL）利用其光动力效应可使Hela 细胞存活率降至56.5%；而在808 nm 激光和可见光同时照射下，C60-Py-GO 体系由于光热和光动力的共同作用，可以杀死更多的Hela 细胞，使其存活率降至20.7%。通过与PEG-GO 体系（图10(b)）进行对照，在同样实验条件下，PEG-GO 仅展示出光热效应，而无光动力效应。这意味着在808 nm 激光和可见光同时照射下，C60-Py-GO 体系可以表现出光热和光动力联合治疗效果。

图10 Hela 细胞在C60-Py-GO 体系(a)和PEG-GO 体系(b)不同处理条件下的存活率Fig.10 Cell viabilities of Hela cells after different treatment C60-Py-GO (a)and PEG-GO (b)

3 结 语

本研究以更加简便、快速、温和的π-π 非共价键相互作用，将C60-Py 与PEG-GO 结合构筑水溶性的C60-Py-GO 纳米体系。该体系基于GO 在808 nm激光照射时的光热效应，能够实现光热治疗效果，同时基于C60在可见光照射下生成1O2，能够实现光动力治疗效果。在808 nm 激光和可见光同时照射下展现出光热和光动力联合治疗效果，可以有效地降低Hela 细胞的存活率。此外，该体系还具有较好的稳定性。该项研究表明，C60-Py-GO 纳米体系具有潜在的应用价值，可进一步开展将其用于杀死其他肿瘤细胞的效果研究。