健康婴儿粪便样本中罗伊氏乳杆菌的分离鉴定与体外益生特性初步研究

鲁 曦， 马雨哲， 李国花， 张明新， 赵 馨， 刘佩肖， 卫飞鹏

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.西安国际医学中心医院， 陕西 西安 710100； 3.空军军医大学 唐都医院， 陕西 西安 710038)

0 引言

肠道菌群从婴儿出生开始迅速建立[1]，并随着生长发育逐步演变，与人体健康密切相关[2,3].肠道是人体益生菌的重要栖息环境，早期肠道菌群的定殖对婴儿的生长发育至关重要[4,5].其中，罗伊氏乳杆菌做为哺乳动物肠道中的固有微生物黏附于道粘膜层[6,7]，不仅能够和其他乳酸菌一样产生酸性代谢产物[8]，还能够分泌罗伊氏菌素[9]、胞外多糖等功能成分，抑制宿主肠道病原体的增殖与黏附，对广泛的pH环境与消化作用亦具有较强的耐受力[8,10].因此从健康婴儿粪便样本中分离的罗伊氏乳杆菌，更加适应人体肠道环境，不仅利于人体肠道的定殖，而且具有潜在的益生活性.

多项随机对照临床研究发现[11-14]，罗伊氏乳杆菌DSM 17938能够在一定程度上缓解婴儿肠绞痛、降低抗生素相关腹泻发生频率以及抑制幽门螺杆菌感染.而且，2003年根据《益生菌类保健食品评审规定》批准罗伊氏乳杆菌为可用于保健食品的益生菌菌种；2014年更新可用于婴幼儿食品的菌种名单的公告同意罗伊氏乳杆菌(菌株号DSM17938)用于婴幼儿食品.虽然罗伊氏乳杆菌具有显著的益生功能，但目前菌种产权集中在瑞典等国，因此分离筛选出具有自主知识产权的罗伊氏乳杆菌菌种，并对其安全性、有效性进行评价，为开发出适宜国人肠道健康和人群特点益生菌产品提供菌种资源具有重要意义[15,16].

肠毒性大肠杆菌(ETEC)是发展中国家婴幼儿腹泻的要病原体，且缺乏有效疫苗.造成了全球每年2亿人次感染、38万5岁以下儿童死亡，严重威胁着人类健康[17-20].

鉴于罗伊氏乳杆菌益生特性与ETEC的危害，本研究从健康婴儿粪便样本中分离罗伊氏乳杆菌，并在体外评价其耐酸耐胆盐能力，并对具有ETEC的抑制功能的菌株进行筛选.该研究对缓解婴儿ETEC腹泻、促进肠道健康具有一定的理论和现实意义.

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂和仪器

1.1.1 实验材料

来自某母婴护理中心的24份健康婴儿新鲜粪便样本，该研究通过空军军医大学唐都医院医学伦理委员会许可(201903-29)，并获得被试者知情同意；罗伊氏乳杆菌标准株 DSM17938；肠毒性大肠杆菌 H10407为本实验室保存.

1.1.2 实验试剂

牛肉膏、酵母膏购于北京奥博星生物技术公司；蛋白胨购于牛津有限责任公司；纤维二糖、水杨苷、山梨醇、麦芽糖、溴甲酚紫购于北京梦怡美生物科技有限公司；无菌无酶水、50×TAE缓冲液(pH8.0)购于陕西中晖赫彩生物医药科技有限公司；引物27F、引物1492R由生工生物工程股份有限公司合成；2×pro Taq Master mix(dye plus)、GL DNA Marker 2000、琼脂糖凝胶购于艾科瑞生物工程有限公司.牛磺脱氧胆酸钠购自上海源叶生物科技有限公司.

1.1.3 实验仪器

SW-CJ-2FD洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；DHG-303-4B电热恒温培养箱，浙江力辰仪器科技有限公司； YDS-10-80液氮生物容器，乐山市东亚机电工贸有限公司；TC1000-G PCR梯度基因扩增仪，大龙兴创实验仪器(北京)股份公司；TGL-16M台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；BM2000生物显微镜，南京麦迪森仪器有限公司；DW-YL270 医用低温箱，中科美菱低温科技股份有限公司；721型分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 样本的采集和处理

婴儿背景信息：本研究样本采集对象为出生1～7周内，体重在2.4～3.5公斤的婴儿，每个婴儿采集大约1g的粪便样本.其中男婴占60.9%，女婴占30.1%.

样本采集：使用一次性无菌拭子在婴儿肛周采集新鲜粪便样本，放入Cary-Blair运送培养基(硫乙醇酸钠1.5 g/L，NaCl 5.0 g/L，Na2HPO41.1 g/L，CaCl20.09 g/L，琼脂 1.0 g/L，pH 8.4±0.1)，4 ℃运送至实验室立即分离鉴定.样本处理：将带有新鲜粪便样品的拭子放入1 mL灭菌生理盐水涡旋30～60 s，制成均匀的样本悬液并进行10倍系列稀释.

1.2.2 菌株的分离纯化

取不同稀释度200μL均匀的涂布在MRS琼脂培养基(10.0 g蛋白胨，10.0 g牛肉膏，5.0 g酵母膏，2.0 g(NH4)2HC6H5O7，20.0 g 葡萄糖，1.0 mL 吐温 80，5.0 g CH3COONa·3H2O，2.0 g K2HPO4·3H2O，0.50 g MgSO4·7H2O，0.25 g MnSO4·H2O，15.0 g 琼脂，1 000 mL 蒸馏水，pH 6.4±2)上，37 ℃下培养72 h，对可疑菌落在新鲜MRS平板上重新划线继续分离培养72 h，随后每个平板挑取3个单菌落进行革兰氏染色镜检为革兰氏阳性菌后，接种到MRS液体培养基中培养24 h并进行后续鉴定.

1.2.3 菌株的鉴定

(1)形态特征观察

对疑似乳酸菌的菌株在MRS平板划线分离，观察菌落颜色、质地、直径；革兰氏染色菌体颜色、形状.

(2)生化鉴定

按照GB4789.35 生化鉴定方法[21]，进行纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、水杨苷、蔗糖、棉子糖发酵试验等生化检测，根据颜色变化判断阴性(黄色)或阳性(紫灰色).

(3) 16S rRNA的扩增和序列分析

PCR反应：首先取菌液1 mL 12 000 r/min离心3 min，弃上清液.在沉淀物中加入400μL无菌蒸馏水重悬，100 ℃加热5 min后，12 000 r/min离心5 min，上清液即为模板DNA.随后按照2×pro Taq说明书，配制反应液，包含：10μL 2× pro Taq Master mix，0.2μL上下游引物(通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，1μL模板DNA，去离子水(DW)补充至20μL，进行PCR反应条件见表1所示.

表1 PCR反应条件

16S rRNA测序及BLAST对比：本研究委托生工生物工程股份有限公司对PCR样本进行测序.对测序得到的序列结果进行BLAST分析，将序列相似度>97%的配对结果作为菌株的鉴定结果[19].进一步，下载罗伊氏乳杆菌标准株16S rRNA序列，利用MEGA7.0系统发育软件，使用邻接算法绘制系统发育树，确定其具体种属.

1.2.4 耐酸耐胆盐特性评价

首先使用1 M盐酸将MRS肉汤培养基pH调整为2和3，并在灭菌后复测pH.另外，用过滤除菌法配置胆盐(牛黄脱氧胆酸钠)母液，再添加到灭菌的MRS肉汤培养基中，使胆盐终浓度分别为0.3%和1%.随后，将过夜培养的罗伊氏乳杆菌按1∶100接种至不同pH或不同胆盐浓度的的MRS肉汤培养基4 mL，并以pH=6.5和不含胆盐的MRS肉汤做为对照条件，37 ℃培养0～4 h，取100μL用平板计数法检测活菌数.

1.2.5 ETEC抑菌功能评价

采用牛津杯法进行抑菌试验，具体方法如下：首先挑取ETEC单菌落，接种到LB肉汤培养基中，设置摇床转速160 r/min，37 ℃培养12 h.测量菌液在600 nm处吸光度，并稀释至OD600 nm=1.取稀释过后的ETEC 菌液100μL，均匀涂布在含有1.5%琼脂的的LB平板上，随后在上述LB平板上分散放置5个牛津杯,倒入1% LB琼脂培养基，待其凝固后将牛津杯取出.接着，将本研究分离得到，并且提前活化好的罗伊氏乳杆菌，取其发酵上清液100μL 加入孔内，37 ℃下培养48 h[20]观察测量抑菌圈直径.

1.2.6 数据统计分析

实验均为三次生物学重复，数据采用均值±标准差表示，组间均数采用方差分析(ANOVA)进行显著性检验，差异显著水平为α=0.05.利用GraphPad 7绘制统计图表.

2 结果与讨论

2.1 菌株分离与鉴定结果

鉴定流程与结果参见图1所示.本研究从24例健康婴儿粪便样本中利用MRS培养基厌氧培养，并连续划线分离，共得到183株乳酸菌可疑菌株，菌落特征信息参见表2所示.按照GB4789.35中糖发酵实验检测上述菌株对碳源的利用能力，生化鉴定法初步鉴定出：副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌25株、嗜酸乳杆菌32株、罗伊氏乳杆菌1株、植物乳杆菌59株.

图1 乳酸菌分离流程初步鉴定结果

表2 可疑乳酸菌菌落特征及革兰氏染色结果

此外，本研究还利用27F和1492R通用引物对上述菌株16S rRNA序列进行PCR扩增，扩增产物进行Sanger测序，将序列进行BLAST比对.

初步鉴定出罗伊氏乳杆菌5株，加氏乳杆菌2株.本研究发现：生化鉴定结果与分子生物学鉴定结果差异较大，这种不一致的现象与前人研究结果类似[22],微生物对生化底物利用能力存在一定交叉，是造成这种差异的可能原因之一，本研究采用了测序结果最为鉴定的最终结果.

2.2 进化树分析结果

本研究将5株初步鉴定的罗伊氏乳杆菌(GH221-4、GH319-13、GH812-16、GH812-17和GH329-22)，经PCR扩增后得到长度大约1456 bp的16S RNA基因序列与GeneBank数据库中部分乳酸菌16S RNA基因序列，利用MEGA 7构建系统发育树.由发育树(图2)可知：菌株GH812-16与GH812-17同源性为99%，它们与罗伊氏乳杆菌(AAA64571.1)同源性为97%；GH211-13和GH319-4与罗伊氏乳杆菌(NR075036)亲缘关系最为接近，同源性分别为96%和95%；此外GH329-22与ABB02610.1亲缘关系最为接近，同源性为98%.

图2 菌株16S rRNA基因序列系统发育树

2.3 耐酸耐胆盐能力

益生菌发挥功能的主要场所是肠道，因此需要耐受消化系统的酸性和胆盐环境.食物通过人体胃部消化时间一般<4 h；而正常人体胃液pH介于2～3之间波动[22,23]；人体十二指肠内胆盐浓度为0.3%左右.本研究选择pH为2.0和3.0、胆盐含量为0.3%和1%进行耐酸耐胆盐能力测试.

耐酸结果如图3所示：本研究分离到的5株罗伊氏乳杆菌在pH=6.5(Control组)条件下，干预4 h后活菌数相比0 h显著提高(P<0.05).而在pH=3和pH=2条件下干预4 h，只有GH211-4号菌的活菌数随时间显著提高(P<0.05)，GH319-13、GH812-17和GH329-22活菌数维持不变(P>0.05).在pH=2处理4 h后，5株罗伊氏乳杆菌活菌数相比对照条件(pH=6.5)均发生显著下降(P<0.05)，但GH211-4和GH319-13在该条件下活菌率相对其他3株较高(P<0.05).

图3 罗伊氏乳杆菌耐酸实验结果

图4 罗伊氏乳杆菌耐胆盐实验结果

耐胆盐结果如图4所示：在胆盐浓度为1%处理4 h后仅有GH329-22号活菌数与对照条件相比无显著差异(P>0.05)，其余4株活菌数在该条件下均被显著抑制(P<0.05).但是，在胆盐浓度为0.3%处理4 h的条件下，除GH812-17号菌之外，其余4株活菌数相比对照组均无显著差异(P>0.05).

罗伊氏乳杆菌对酸性与胆盐环境耐受是其重要益生特征之一[8]，本研究分离到的5株罗伊氏乳杆菌虽然对酸性与胆盐环境均具有一定耐受性，但存在一定差异,例如GH329-22能够耐受4 h，1%胆盐环境，但pH=3处理4 h后，活菌数却发生显著下降.综合上述结果，GH211-4和GH812-13号能够同时对酸性与胆盐环境具有一定的耐受力.

2.4 对ETEC抑制效果

本研究利用牛津杯法测试了罗伊氏乳杆菌MRS发酵上清液对ETEC抑菌效果，结果如图5所示，其中GH612-16号菌抑菌圈直径为10.35±0.72 mm，显著高于对照组(6.0±0.13 mm).提示该菌可能对ETEC具有一定的抑菌能力.

图5 5株罗伊氏乳杆菌发酵上清液对ETEC的抑制功能

ETEC是一种导致婴儿腹泻和仔猪腹泻的致病微生物，而抗生素是治疗其感染常规手段.但是抗生素除了可能导致菌体耐药之外，还可以通过破坏肠道菌群结构与稳态，进而损伤肠道功能.因此抗生素替代疗法将成为未来新型抗菌技术发展的重要方向之一.

罗伊氏乳杆菌可以通过分泌罗伊氏菌素、胞外多糖等功能成分对常见病原体，例如金黄色葡萄球菌、沙门氏菌具有明显的抑制效果，而且对轮状病毒引起的肠炎具有明显的改善作用.

筛选得到的人源性罗伊氏乳杆菌可以作为一种益生菌源用于后续益生菌产品开发，根据可用于婴幼儿食品的菌种名单，罗伊氏乳杆菌可被添加到婴儿食品中，帮助婴儿改善肠道菌群结构，提高婴儿免疫力.

3 结论

本研究从24例健康婴儿粪便样本中分理处5株罗伊氏乳杆菌，均具有一定的酸性与胆盐环境的耐受性，其中GH211-4和GH319-13能够对pH=3和0.3% 胆盐处理4 h的试验条件具能较好耐受.此外，本研究还筛选出1株对ETEC具有显著抑制功能的罗伊氏乳杆菌(GH812-16)，能够在pH=2 和0.3%胆盐环境中耐受2 h，该菌为缓解婴儿ETEC腹泻、促进肠道健康具有一定的理论和现实意义.

肠道菌群的建立对婴儿生长发育至关重要，而罗伊氏乳杆菌做为一种天然存在于人体肠道的共生微生物而且具有抑制致病菌、促进肠道免疫细胞分化和免疫调节的功能.然而，由于人群个体差异和菌种差异的不同，使得目前益生菌临床研究喜忧参半，因此对功能菌株的筛选与鉴定至关重要.