老年2型糖尿病病人心血管病死亡相关外周血全基因组DNA甲基化的研究

樊垚 王强 唐吉宏 娄青林 唐伟 顾刘宝

T2DM是一种复杂的多基因多因素疾病。近年来，越来越多的研究者在分子水平探讨T2DM的发病机制并关注其早期诊断及预防。大量全基因组关联研究(genome-wide association studies，GWASs)发现，有240余个易感基因与T2DM或其并发症有关[1]，然而这些易感基因只能解释其中很小一部分原因[2-3]。近年来研究发现，在复杂疾病中，除基因组序列变异外，表观遗传调控也起到重要作用，因此有必要对糖尿病相关的表观遗传学等分子机制进行深入研究[4]。

研究表明，糖尿病是心血管疾病的独立危险因素，糖尿病病人心血管疾病的发生风险较非糖尿病者增加2～4倍。DNA甲基化是一种重要的遗传外修饰，是表观遗传学的重要组成部分，是调节基因组功能的重要手段。850K芯片可以检测人全基因组约853 307个CpG位点的甲基化状态。本研究使用850K Infinium Methylation Beadchip技术检测老年T2DM病人外周血全基因组DNA甲基化修饰水平，旨在探讨DNA甲基化修饰与老年T2DM病人心血管病死亡风险的相关性，并寻找可能的干预靶点，为早期防治糖尿病心血管并发症提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 研究对象均来自南京医科大学附属老年医院糖尿病分阶段达标管理(China Staged Diabetes Targeting Management，SDTM)项目注册的T2DM病人。该项目为开放式队列随访研究，自2010年开始招募入组对象，入组条件为签署知情同意书且在本院就诊的T2DM病人，病人均符合中国T2DM防治指南(2010年版)诊断标准。糖尿病专科护士先对所有入组对象进行电话访谈，以确认每位病人的现状，再通过当地疾病控制中心系统的居民数据库对所有死亡数据进行进一步验证。本研究选取截至2017年12月底结局事件为心血管病死亡的病人12例为死亡组，年龄78～89岁，男10例，女2例。根据巢式病例对照设计，按照性别、年龄进行1:1匹配，采用倾向性评分法，卡钳值设置为0.02，最终从数据库中选取截至2017年12月底仍存活的12例病人为非死亡组，年龄78～90岁，男8例，女4例。本研究已通过南京医科大学附属老年医院伦理委员会审核。

1.2 研究方法

1.2.1 生化指标检测：入组时采集病人清晨空腹静脉血4 mL，以分离胶促凝剂保存，4000 r/min离心10 min，取上层血清，采用全自动生化分析仪(雅培c1600)检测TC、TG、HDL-C、LDL-C、UA、AST、ALT等生化指标。

1.2.2 DNA提取：入组时采集病人清晨空腹静脉血2 mL以EDTA抗凝，放置于-80 ℃冰箱冻存。使用德国Qiagen公司血液组织DNA提取试剂盒提取外周血DNA。

1.2.3 DNA甲基化水平检测：入组时使用Illumina公司850K Infinium Methylation Beadchip技术，委托上海晶能生物技术有限公司检测基因组DNA甲基化程度。850K芯片针对每个CpG位点设计2种探针，即signal A和signal B双色荧光信号用于检测非甲基化和甲基化的等位基因。使用R软件minfi包对原始芯片数据进行预处理，CpG位点的甲基化程度通过β值衡量，计算公式为：β=signal B/(signal A+signal B+100)。有效探针β值的区间为[0，1]，0表示该CpG位点无甲基化，1表示该CpG位点完全甲基化。

1.3 统计学处理

1.3.2 基因组甲基化差异分析：使用Beta MIxture Quantile dilation(BMIQ)法对β值进行标准化处理，利用R语言的limma包建立线性模型并计算每个CpG位点的P值。采用Benjamini & Hochberg法进行多重检验校正，根据校正后的P值进行差异甲基化位点的筛选。差异甲基化位点的判断标准为P<0.05，︱βdifferencecase-control︱>0.1。采用R语言的pheatmap包绘制差异甲基化位点基因的热图。

1.3.3 生物信息学分析：将筛选出的差异甲基化位点通过DAVID基因功能分析平台(https://david.ncifcrf.gov)完成基因本体(gene ontology，GO)功能分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信号通路分析。采用Benjamini & Hochberg法进行多重检验校正，以P<0.05为差异甲基化位点基因在该条GO条目和KEGG通路上显著富集。

2 结果

2.1 2组基线一般资料和实验室检测指标比较 非死亡组HDL-C水平高于死亡组，差异有统计学意义(P<0.05)，其他人口学特征、实验室检测指标、疾病史和用药史差异均无统计学意义。见表1。

2.2 DNA甲基化检测结果

2.2.1 Illumina Human Methylation 850 BeadChip芯片的评价：芯片在杂交、洗涤、扫描步骤质控良好，使用BMIQ法对β值进行标准化处理，β值均位于[0，1]区间，表示探针有效，所有数据均可用于后续分析。

2.2.2 差异甲基化位点分析：根据评判标准筛选出差异甲基化位点共303个。根据2组样本在303个差异甲基化位点上的甲基化状态绘制差异甲基化位点基因热图，见图1。

注：Group A为非死亡组，Group B为死亡组；红色为高甲基化，蓝色为低甲基化图1 差异甲基化位点基因热图

2.3 生物信息学分析结果

2.3.1 GO功能分析：GO功能可分为生物过程(biological process，BP)、细胞成分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)3个部分。计算每个GO条目中差异甲基化位点基因富集程度的P值，结果提示差异甲基化位点基因生物学功能富集于神经系统发育、细胞黏附分子、血糖稳态和树突发育正调控等生物过程；质膜的组成成分、树突和细胞质核周区细胞成分；钙离子结合和序列特异性DNA结合分子功能。见图2。

图2 DNA差异甲基化位点基因参与的主要生物过程

2.3.2 通路分析(Pathway 富集分析)：计算每个KEGG通路条目中差异甲基化位点基因富集程度的P值。结果显示，差异甲基化位点基因显著富集在细胞内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)信号通路和炎症介质对瞬时受体电位离子(transient receptor potential, TRP)通道的调节通路。见图3。

图3 DNA差异甲基化位点基因参与的主要信号通路

3 讨论

有研究表明，约30%的T2DM病人有心血管并发症，而70%的T2DM病人死因为心血管疾病[8]。本研究通过对老年T2DM心血管病死亡病人和非死亡病人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的全基因组甲基化芯片检测，筛选出差异甲基化位点基因，初步为老年T2DM心血管病死亡风险的甲基化谱的建立奠定基础。

TRP通道在多种心血管疾病的病理生理学中发挥重要作用[9]。TRPV1是哺乳动物TRP离子通道7个亚家族之一。已有研究表明，TRPV1的缺失可能影响中性粒细胞的迁移，促使炎症因子、趋化因子过度生成，造成心梗后炎症过度活动、不对称心室重塑、心功能恶化[10]。TRPV1基因多态性与T2DM遗传易感性及术中不良心血管事件的发生相关[11]。cAMP是胰高血糖素肽-1受体(glucogan like peptide-1 receptor，GLP-1R)的主要第二信使，其可活化一系列下游分子信号，从而发挥抗氧化应激和抗凋亡等生物学作用[12]。目前大多数研究认为，胰高血糖素肽-1(glucogan like peptide-1，GLP-1)的心血管保护作用独立于血糖和血清胰岛素水平等因素之外[13]，发挥生物学作用的方式是与心脏和血管内皮的GLP-1R相结合[14]。Flamez等[15]发现，GLP-1与胰岛B细胞膜上受体相结合，引起细胞内cAMP水平上升，导致细胞膜电生理变化从而刺激胰岛素分泌。Dozier等[16]研究发现，GLP-1可通过cAMP/PKA通路抑制炎性反应，从而改善脂多糖诱发的内皮细胞功能障碍。Liu等[17]对自发性高血压大鼠予以2周西他列汀治疗，发现大鼠的肾动脉内皮依赖性舒张功能有所改善，肾功能血流恢复，血压降低，其机制可能是通过提高cAMP水平，从而进一步激活蛋白激酶K(protein kinase A, PKA)、AMP依赖的蛋白激酶[Adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK]、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)等分子而发挥作用。以上研究均表明，cAMP/PKA是GLP-1发挥多器官保护作用的一个非常重要的分子通路。

细胞黏附分子在细胞炎症反应、血栓形成等过程中发挥重要作用。本研究GO功能分析结果显示，差异甲基化位点基因参与细胞黏附分子的生物学过程。季慧慧等[18]对T2DM病人和正常对照人群的DNA差异甲基化基因进行GO功能分析，发现多个基因参与细胞黏附分子生物过程。成淑英等[19]发现合并不同程度颈动脉或下肢动脉硬化的T2DM病人血清血管细胞黏附分子1水平显著高于健康对照组。上述研究结果提示，DNA甲基化参与细胞黏附分子生物过程从而影响T2DM病人的心血管疾病进展。

钙离子结合在动脉钙化和动脉粥样硬化过程中起着至关重要的作用[20]。Liang等[21]的研究表明，钙离子结合在糖尿病病人心血管疾病发展过程中被激活。结合本研究结果可以得出，DNA甲基化参与钙离子结合分子功能从而影响T2DM病人的心血管疾病进展。

综上所述，本研究发现DNA甲基化修饰图谱在老年T2DM病人心血管病死亡组与非死亡组中存在显著差异，差异甲基化位点基因显著富集在cAMP信号通路和炎症介质对TRP通道的调节过程中，提示DNA甲基化作为基因表达调控机制，可能通过参与以上生物学过程对T2DM病人心血管病死亡发挥一定作用。本研究采用850K Infinium Methylation Beadchip技术，有较高的稳定性，研究结果有一定参考价值。但由于本研究样本量较小，同时缺少功能研究验证。因此，仍需更多研究来验证本结果的可靠性。