隔药饼灸对动脉粥样硬化易损斑块兔RhoA/ROCK1/MMP-9信号通路的影响

马逸杰，廖意娟，饶泽华，宋家薇，易丽贞，吴雪芬，刘欣，岳增辉

湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是临床常见的以血管弹性下降甚至消失为特点的血管性疾病，通常由于脂质沉积于血管内壁形成斑块所致。AS后期形成的斑块可根据其是否具有破裂出血倾向分为稳定斑块和不稳定斑块，其中不稳定斑块又称易损斑块。易损斑块通常具有薄的纤维帽、大的脂质核心及大量炎症相关细胞。当斑块胶原纤维含量下降导致纤维帽变薄时，斑块的不稳定性增加，易损斑块形成。研究表明，AS的形成和发展与Ras同源物基因组成员A（RhoA）/Rho相关卷曲形成蛋白激酶（ROCK）信号通路及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）关系密切。课题组前期研究发现，隔药饼灸在降低血脂、调节胆固醇、治疗AS及稳定易损斑块方面具有明显作用。因此，本研究通过检测AS易损斑块兔血脂水平，腹主动脉内膜、中膜形态和RhoA、ROCK1、MMP-9蛋白表达，以及胶原纤维含量，探讨隔药饼灸稳定AS易损斑块可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性普通级新西兰大耳白兔70只，体质量（2±0.2）kg，湖南太平生物科技有限公司提供，动物许可证号SCXK（湘）2020-0005。于湖南中医药大学动物中心实验室单笼饲养，温度18～24 ℃，湿度50%～70%，12 h明暗周期，自由饮水。实验中对动物的处置严格遵照中华人民共和国2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》，实验动物操作经湖南中医药大学实验动物伦理委员会批准（LL2019081905）。造模用高脂饲料（含1%胆固醇、10%蛋黄粉、5%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶、83.8%基础饲料），湖南嘉泰实验动物有限公司提供。

1.2 药物及制备

丹参、山楂、郁金、泽泻、大黄药粉，购于湖南中医药大学第一附属医院。药饼制作：每次灸前按等比例取各药粉3～5 g，用陈醋调成糊状，制成厚2～3 mm、直径0.8～1.2 cm的药饼。阿托伐他汀钙片，美国辉瑞公司，批号1237304。Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔，上海源叶生物技术有限公司，货号S32087。艾炷，南阳昊翔药业有限公司，货号hx-0258，规格0.4 cm×0.8 cm。

1.3 主要试剂与仪器

Ad5-p53重组载体，深圳赛百诺，批号20130602；斑点蝰蛇毒，广西医科大学蛇毒研究所制备；组胺，上海三杰生物，批号20110901；MMP-9、RhoA抗体，湖南艾方生物，货号分别为AF300248、AF03289；ROCK1、羊抗兔IgG抗体，武汉赛维尔，货号分别为GB11265、GB23303；DAB显色剂、HE染液、天狼猩红染液，武汉赛维尔，货号分别为G1211、G1005、G1018。E100显微镜（日本Nikon公司），JB-P5石蜡包埋机（武汉俊杰电子有限公司），RM2016病理切片机（德国徕卡仪器有限公司），Pannoramic DESK全景切片扫描仪（匈牙利3DHISTECH公司），D3024R型台式高速冷冻微量离心机（北京大龙仪器）。

1.4 造模及分组

参照文献[9]方法，采用高脂饲料喂养＋球囊损伤＋基因转染＋药物触发的方式进行造模。将70只实验兔随机分为空白组10只、手术组60只。手术组高脂饲料喂养2周后，行腹主动脉球囊损伤术：20%乌拉坦耳缘静脉注射（5 mL/kg）麻醉，肝素钠200 U/kg抗凝，沿兔右侧腹股沟下缘股动脉搏动处剔除毛发，切开皮肤及肌肉组织，将右股动脉与其他组织及静脉血管分离，将股动脉下缘结扎，结扎上缘行穿刺术，逆行插入导引导丝约20 cm，再插入带有球囊的导引导管，当球囊导管完全插入血管后，撤出导引导丝，继续插入球囊导管约20 cm，手推式球囊扩张压力泵注入生理盐水，转动压力泵使大气压保持在607.98～810.64 kPa，自近心端将球囊向外缓慢回拉，反复抽拉3次，以达到损伤腹主动脉内皮的目的。撤出导管，结扎右侧股动脉，逐层缝合肌肉、皮肤。术后连续3 d肌肉注射青霉素（40万U/d）防止感染。

手术过程5只兔死亡，存活55只，将存活兔随机分为模型组、直接灸组、隔药饼灸、西药组和抑制剂组，每组11只。术后各组兔继续高脂饲料喂养并进行相应干预，连续8周。

干预结束后，对除空白组外的所有实验兔进行基因转染：20%乌拉坦耳缘静脉注射（5 mL/kg）麻醉兔，剃除兔左侧腹股沟下缘股动脉搏动处毛发，常规消毒，按球囊损伤的方法将球囊送入需转染部位，用球囊注入滴度为1.0×10VP/mL的Ad5-p53重组载体20 μL，撤出球囊并结扎左侧股动脉，逐层缝合肌肉、皮肤。术后连续3 d肌肉注射青霉素（40万U/d）预防感染。基因转染时间为2周，同时改为普通饲料喂养。

分别于兔处死前48、24 h进行2次药物触发，具体操作：腹腔注射斑点蝰蛇毒0.15 mg/kg，30 min后耳缘静脉注射组胺0.02 mg/kg，以诱发斑块破裂。

1.5 干预

参照《实验针灸学》及拟人比照法取穴，第1组为“巨阙”、双侧“天枢”“丰隆”，第2组为双侧“心俞”“肝俞”“脾俞”。对兔取穴定位后剪毛，固定于兔台，直接灸组将艾炷直接粘于穴位上（下有厚3 mm、直径10 mm的纸质垫盘），点燃施灸，每穴连续灸3壮（约30 min），每日1次，2组穴位隔日交替施灸；隔药饼灸组将药饼粘于穴位上，再将艾炷放置于药饼上点燃施灸，其余操作同直接灸组；西药组每日抓取固定30 min后，将阿托伐他汀钙片研磨成粉，按1.96 mg/（kg·d）拌入高脂饲料中喂食；抑制剂组每日抓取固定30 min后，经耳缘静脉分2次注射盐酸法舒地尔10 mg/（kg·d），间隔3 h；空白组和模型组每日抓取固定30 min，不干预。连续8周。

1.6 取材

耳缘静脉注射20%乌拉坦（5 mL/kg）麻醉兔，腹部正中切口，腹主动脉采血2～3 mL，3 000 r/min离心15 min，吸取血清，置于-80 ℃冰箱保存。取主动脉弓至髂总动脉分叉处腹主动脉组织，置于4%多聚甲醛中固定。

1.7 检测指标

1.7.1 ELISA检测

取离心后血清，按ELISA试剂盒说明书检测血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量。

1.7.2 HE染色

将固定于4%多聚甲醛中的腹主动脉组织取出，石蜡包埋，切片（厚度4 μm），常规HE染色，脱水后中性树脂封片。显微镜下观察腹主动脉内膜和中膜形态。

1.7.3 免疫组化染色

取腹主动脉组织石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，柠檬酸抗原修复缓冲液（pH 6.0）进行抗原修复，加3%过氧化氢溶液室温避光孵育25 min阻断内源性过氧化物酶，加3%BSA封闭1 h，滴加稀释的RhoA（1∶100）、ROCK1（1∶100）、MMP-9（1∶50）一抗，4 ℃孵育过夜，滴加羊抗兔IgG二抗，室温孵育50 min，DAB显色，苏木素复染，自来水冲洗，脱水，封片，显微镜下观察，以棕黄色颗粒为阳性表达，采用Aipathwell图像分析软件计算阳性表达的平均光密度。

1.7.4 天狼猩红染色

将腹主动脉组织石蜡切片置于天狼猩红染液中染色8～10 min，脱水，封片，显微镜下观察胶原纤维分布情况，以红色染色为胶原纤维阳性表达，采用Aipathwell图像分析软件计算胶原纤维面积，以胶原纤维面积占组织总面积百分比计算胶原纤维含量。

1.8 统计学方法

采用SPSS25.0统计软件进行分析。实验数据以±表示，满足正态分布多组间比较采用方差分析，方差齐用LSD法，方差不齐用Tamhane’s T2检验，不满足正态分布用秩和检验。＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

最终存活50只兔，其中空白组8只、模型组9只、直接灸组9只、隔药饼灸组7只、西药组9只、抑制剂组8只。

2.1 隔药饼灸对模型兔血脂水平的影响

与空白组比较，模型组兔血清HDL-C含量显著减少（＜0.01），LDL-C含量显著增加（＜0.01）；与模型组比较，直接灸组、隔药饼灸组和西药组兔血清HDL-C含量显著增加（＜0.01，＜0.05），LDL-C含量显著减少（＜0.01）。见图1。

图1 各组兔血清HDL-C和LDL-C含量比较（±s，每组7～9只）

2.2 隔药饼灸对模型兔腹主动脉病理变化的影响

空白组兔腹主动脉组织结构清晰，内膜光滑完整，内皮细胞排列紧密；模型组兔腹主动脉组织结构紊乱，内膜明显增厚形成斑块，表面粗糙，斑块处有大量脂质沉积及少量红细胞，内皮细胞结构不完整，内膜、中膜界限模糊；各治疗组腹主动脉病理改变均有不同程度改善。见图2。

图2 各组兔腹主动脉组织形态（HE染色，×200）

2.3 隔药饼灸对模型兔腹主动脉组织RhoA、ROCK1、MMP-9蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组兔腹主动脉组织RhoA、ROCK1、MMP-9蛋白表达显著升高（＜0.01）；与模型组比较，直接灸组、隔药饼灸组、西药组和抑制剂组兔腹主动脉组织RhoA和ROCK1蛋白表达显著降低（＜0.01），隔药饼灸组、西药组和抑制剂组兔腹主动脉组织MMP-9蛋白表达显著降低（＜0.01）。见图3～图6。

图3 各组兔腹主动脉组织RhoA蛋白阳性表达（免疫组化染色，×400）

图4 各组兔腹主动脉组织ROCK1蛋白阳性表达（免疫组化染色，×400）

图5 各组兔腹主动脉组织MMP-9蛋白阳性表达（免疫组化染色，×400）

图6 各组兔腹主动脉组织RhoA、ROCK1、MMP-9蛋白表达比较（±s，每组7～9只）

2.4 隔药饼灸对模型兔腹主动脉组织胶原纤维含量的影响

与空白组比较，模型组兔腹主动脉组织胶原纤维含量显著减少（＜0.01）；与模型组比较，直接灸组、隔药饼灸组和西药组兔腹主动脉组织胶原纤维含量显著增加（＜0.01，＜0.05），抑制剂组兔腹主动脉组织胶原纤维含量呈增加趋势，但差异无统计学意义异（＞0.05）。见图7、图8。

图7 各组兔腹主动脉组织胶原纤维阳性表达（天狼猩红染色，×100）

图8 各组兔腹主动脉组织胶原纤维含量比较（±s，每组7～9只）

3 讨论

《素问•痹论篇》云：“脉痹不已，复感于邪，内舍于心……所谓痹者，各以其时重感于风寒湿之气也……痹在于脉则血凝而不流。”AS属中医学“脉痹”范畴，主要由痰瘀痹阻血脉而成，故以疏肝理气通络、益气活血祛瘀为主要治法。艾灸主要有温经通络、散寒驱邪等功效。药饼由丹参、山楂、郁金、泽泻和大黄组成，有活血祛瘀止痛、清心除烦、养血安神之功。现代研究表明，上述药物有调节血脂的功效。本实验选择“巨阙”“天枢”“丰隆”及“心俞”“肝俞”“脾俞”2组穴位交替进行治疗，其中“巨阙”“天枢”为心与大肠之募穴，“心俞”“肝俞”“脾俞”分别为其脏腑之背俞穴，“丰隆”为治痰之要穴。因此，选穴采取俞募配伍加治痰的方式以达血脉充盈、疏肝健脾、调理肠胃功效，进而起到活血祛瘀、化痰调脂作用。

AS是众多心血管疾病的病理基础，其早期主要以血脂水平升高、脂质在血管内壁沉积为特点。HDL-C、LDL-C含量是反映机体脂质代谢情况的重要指标。HDL-C能将胆固醇从肝外组织转运到肝脏进行代谢，降低血液胆固醇含量，抑制AS形成。LDL-C能将胆固醇转运到肝外组织细胞，造成血液胆固醇含量增加，促进AS形成与发展。既往研究发现，隔药饼灸能有效降低AS兔血清HDL-C、LDL-C、三酰甘油及胆固醇含量。本研究结果表明，经隔药饼灸干预后，模型兔血清HDL-C含量显著增加，LDL-C含量显著减少，提示隔药饼灸能有效调节AS兔血脂水平。

易损斑块是在AS末期出现的不稳定性斑块，易损斑块破裂将诱导血栓形成，导致血管堵塞，进而引起急性心血管疾病。与稳定斑块相比，易损斑块表面纤维帽更薄、脂质核更大，易损斑块附近炎性因子更多。当斑块中胶原纤维含量降低时，斑块的纤维帽变薄，同时，斑块不稳定性增加形成易损斑块。RhoA/ROCK信号通路与心血管疾病、糖尿病、神经损伤性疾病和肿瘤等疾病的发生发展密切联系。RhoA是Rho GTP酶的一个分支，其可以在活性GTP结合形式和非活性GDP结合形式之间循环。ROCK是RhoA下游靶蛋白之一，可分为ROCK1和ROCK2亚型，ROCK1在应力纤维形成中起关键作用，ROCK2在吞噬和细胞收缩中起重要作用。MMP-9是一种锌依赖性内切蛋白酶，主要由内皮细胞、血管平滑肌细胞和巨噬细胞等分泌产生，参与斑块纤维帽中胶原纤维的降解，促进稳定斑块向易损斑块转化，MMP-9的表达受RhoA/ROCK信号通路的调控，抑制RhoA/ROCK信号通路则MMP-9表达降低。本实验结果表明，经隔药饼灸治疗后，AS兔腹主动脉组织RhoA、ROCK1、MMP-9蛋白表达均显著降低，表明隔药饼灸能抑制RhoA/ROCK1/MMP-9信号通路。当MMP-9蛋白表达降低时，胶原纤维含量明显增加，提示抑制MMP-9表达能通过减少胶原纤维降解起到稳定斑块的作用。抑制剂组MMP-9蛋白表达最低，但其胶原纤维含量较其他治疗组并未体现升高趋势，可能由于各治疗组能通过多途径对胶原纤维含量进行调控，具体机制有待进一步实验研究。

综上所述，隔药饼灸可能通过抑制RhoA/ROCK1/MMP-9信号通路，增加胶原纤维含量，进而增加纤维帽厚度，延缓AS发展，稳定易损斑块。