天麻芎苓止眩片对自发性高血压大鼠Atg8、LC3及p62表达的影响

邵乐，李苏，雍苏南

湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007

据统计，全球现有高血压患者已超过10亿，每年近200万人因血压升高导致死亡。高血压病已成为危及人类健康的首要疾病，但其发病机制尚未完全阐明。已有研究表明，炎症状态下炎症因子稳态失衡，导致血管结构改变，血管重塑明显，从而引发高血压。自噬与炎症小体激活关系密切，可通过参与细胞器新陈代谢和能量产生，发挥调控炎症作用。同时，自噬本身也是高血压的病理因素之一，研究发现，在肾血管性高血压模型中可见线粒体自噬增强，而使用缬沙坦干预可明显抑制线粒体自噬，降低血压，保护靶器官。天麻芎苓止眩片由湖南中医药大学第一附属医院治疗高血压经验方复方七芍降压片化裁而成。课题组前期研究表明，天麻芎苓止眩片降低血压与减轻炎症反应、保护血管内皮损伤、改善血管重塑、保护肾功能有关。本实验采用天麻芎苓止眩片干预自发性高血压大鼠，观察其对大鼠血清炎症因子白细胞介素（IL）-1、IL-10含量和胸主动脉组织Atg8、LC3、p62表达的影响，明确天麻芎苓止眩片治疗高血压的作用机制，为其临床应用与后续研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性自发性高血压大鼠30只，8周龄，体质量180～200 g；雄性WKY大鼠10只，体质量180～200 g，均购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK（京）2016-0006，饲养于湖南中医药大学第一附属医院实验动物中心。

1.2 药物及制备

天麻芎苓止眩片（天麻15 g，钩藤15 g，野菊花12 g，川芎10 g，茯苓15 g，法半夏6 g，牡蛎6 g，地龙15 g，钩藤10 g，罗布麻18 g，酸枣仁9 g，甘草6 g，香附10 g，丹参15 g），由湖南中医药大学第一附属医院制剂中心制备，规格0.46 g/片，批号20200216，将药物研磨成粉，加超纯水溶解，配制成浓度为4.32 mg/mL药液。卡托普利片，特一药业集团股份有限公司，批号20200518，规格25 mg/片，研磨成粉后加超纯水溶解，配制成浓度为0.76 mg/mL溶液。

1.3 主要试剂与仪器

大鼠IL-1、IL-10 ELISA试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司，批号分别为GR2020-06、GR2020-12），p62、LC3、Atg8一抗（北京博奥森生物技术有限公司，批号分别为AI48095842、CW88845705、EE74800668）。BP2010智能无创血压计，北京软隆科技有限公司；PL-203电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；BX50显微镜，日本OLYMPUS公司；CFX Connect型定量PCR仪，美国Bio-Rad公司；SYSTEM GelDoc XR+凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司。

1.4 分组及给药

30只自发性高血压大鼠随机分为模型组、卡托普利组和天麻芎苓止眩片组，每组10只，另设10只WKY大鼠为正常对照组。卡托普利组和天麻芎苓止眩片组分别予7.6、43.2 mg/kg相应药液灌胃，正常对照组及模型组予蒸馏水灌胃，给药体积均为10 mL/kg，每日1次，连续8周。

1.5 检测指标

1.5.1 收缩压测定

1.5.2 炎症因子检测

干预结束后，腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉大鼠，经腹主动脉取血，室温静置10～20 min，2 000 r/min离心20 min，收集血清，按ELISA试剂盒说明书检测IL-1、IL-10含量。

1.5.3 胸主动脉病理形态观察

分离大鼠胸主动脉，取部分组织置于10%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脱水，透明，将已透明组织置于石蜡中浸蜡，包埋，切片（厚度5 μm），常规HE染色，中性树胶封片。显微镜下观察胸主动脉病理变化。

1.5.4 免疫组化检测

取大鼠胸主动脉组织石蜡切片，依次放入二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇中脱蜡，10%山羊血清室温封闭5～10 min，滴加Atg8、LC3、p62一抗（均为1∶100），4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶200），37 ℃孵育20 min，PBS洗涤3 min×3次，DAB染色5 min，苏木素复染，分化，返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察，采集图像，以棕黄色染色为阳性表达，计算阳性表达的积分光密度（IOD）。

1.5.5 Western blot检测

一是把自己的思想装进别人的脑袋，二是把别人的钱装进自己的口袋。前者成功了叫老师，后者成功了叫老板，两者都成功了叫老婆。

取大鼠胸主动脉组织，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白上样，电泳、转膜后，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。滴加Atg8、LC3、p62一抗（均为1∶1 000），室温孵育1 h，PBST洗膜5 min×3次。加入HRP标记二抗（1∶10 000），室温孵育1 h，PBST洗膜5 min×3次，ECL发光液显影，凝胶成像系统采集图像，以GAPDH为内参，采用AlphaEase FC软件分析目的蛋白灰度值。

1.5.6 RT-PCR检测

取大鼠胸主动脉组织，加入Trizol试剂，4 ℃充分匀浆，室温静置5 min，加入0.2 mL氯仿振荡15 s，室温静置5 min，取上清液于1.5 mL EP管中，加等体积异丙醇沉淀RNA，加入DEPC水溶解RNA沉淀，按试剂盒说明书将RNA反转录合成cDNA。PCR反应条件：95 ℃、10 min，95 ℃、10s，60 ℃、20 s，72 ℃、15 s，85 ℃、10 s，25 ℃、30 s，共45个循环，引物序列见表1。以GAPDH为内参，采用2法计算mRNA相对表达量。

表1 各基因PCR引物序列

1.6 统计学方法

采用SPSS25.0统计软件进行分析。实验数据以±表示，多组间比较符合正态性及方差齐性采用方差分析，两两比较采用LSD-检验，方差不齐采用秩和检验。＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 天麻芎苓止眩片对自发性高血压大鼠收缩压的影响

与同时点正常对照组比较，模型组大鼠收缩压明显升高（＜0.05）；给药第1周开始，与模型组比较，卡托普利组大鼠收缩压明显降低（＜0.05）；给药第3周开始，与模型组比较，天麻芎苓止眩片组大鼠收缩压明显降低（＜0.05）；给药第6周后，天麻芎苓止眩片组与卡托普利组大鼠收缩压差异无统计学意义（＞0.05）。见图1。

图1 各组大鼠给药不同时点收缩压比较（±s，每组10只）

2.2 天麻芎苓止眩片对自发性高血压大鼠血清白细胞介素-1、白细胞介素-10含量的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠血清IL-1含量明显增加，IL-10含量明显减少（＜0.05）；与模型组比较，卡托普利组和天麻芎苓止眩片组大鼠血清IL-1含量明显减少，IL-10含量明显增加（＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠血清IL-1、IL-10含量比较（±s，每组10只）

2.3 天麻芎苓止眩片对自发性高血压大鼠胸主动脉病理形态的影响

HE染色显示，正常对照组大鼠胸主动脉内膜连续、平整，内皮完整，平滑肌细胞整齐排列；模型组大鼠胸主动脉内膜粗糙、断裂，平滑肌细胞增多且排列紊乱，血管壁显著增厚；天麻芎苓止眩片组大鼠胸主动脉内膜损伤减轻，平滑肌细胞排列较为规则，管壁厚度正常。见图3。

图3 各组大鼠胸主动脉形态（HE染色，×400）

2.4 天麻芎苓止眩片对自发性高血压大鼠胸主动脉组织Atg8、LC3、p62蛋白表达的影响

免疫组化结果显示，与正常对照组比较，模型组大鼠胸主动脉组织Atg8、LC3、p62蛋白表达明显升高（＜0.05）；与模型组比较，卡托普利组和天麻芎苓止眩片组大鼠胸主动脉组织Atg8、LC3、p62蛋白表达明显降低（＜0.05）。见表2、图4。

表2 各组大鼠胸主动脉组织Atg8、LC3、p62蛋白表达比较（±s，IOD）

图4 各组大鼠胸主动脉组织Atg8、LC3、p62蛋白阳性表达（免疫组化染色，×400）

Western blot结果显示，与正常对照组比较，模型组大鼠胸主动脉组织Atg8、p62蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高（＜0.05）；与模型组比较，天麻芎苓止眩片组和卡托普利组大鼠胸主动脉组织Atg8、p62蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显降低（＜0.05）。见图5、图6。

图5 各组大鼠胸主动脉组织Atg8、LC3、p62蛋白免疫印迹

图6 各组大鼠胸主动脉组织p62、LC3、Atg8蛋白表达比较（±s，每组10只）

2.5 天麻芎苓止眩片对自发性高血压大鼠胸主动脉组织Atg8、LC3Ⅱ、p62 mRNA表达的影响

RT-PCR结果显示，与正常对照组比较，模型组大鼠胸主动脉组织Atg8、LC3Ⅱ、p62 mRNA表达明显升高（＜0.05）；与模型组比较，卡托普利组和天麻芎苓止眩片组大鼠胸主动脉组织Atg8、LC3Ⅱ、p62 mRNA表达明显降低（＜0.05）。结果见表3。

表3 各组大鼠胸主动脉组织Atg8、LC3Ⅱ、p62 mRNA表达比较（±s）

3 讨论

高血压病属中医学“眩晕”“头痛”范畴，其病机可用虚、瘀、风概括，以肝肾阴虚为本，肝阳上扰、瘀血阻络为标。天麻芎苓止眩片以天麻为君，平肝熄风止痉，臣以钩藤、川芎活血行气、祛风止痛，佐以茯苓、法半夏、野菊花健脾化痰、平肝清热，全方共奏平肝熄风、健脾逐瘀之效。

有研究表明，炎症因子IL-1可以损伤血管内皮细胞及平滑肌细胞，引起血管壁管腔狭窄，增加血管阻力，在高血压发生、发展过程中发挥重要作用。IL-10是一种与高血压密切相关的抗炎因子，可以通过抑制IL-1、IL-8等促炎因子的产生减轻炎症损伤，从而保护内皮组织，抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移，进而降低血压，改善血管重塑。本研究中，与正常对照组比较，模型组大鼠血清炎症因子IL-1含量增加，IL-10含量减少，大鼠胸主动脉内膜粗糙、断裂，表明存在炎症稳态失衡及内皮损伤。与模型组比较，天麻芎苓止眩片组大鼠血压降低，血清炎症因子IL-1含量减少，IL-10含量增加，胸主动脉内膜损伤及炎症水平得到明显改善。

线粒体应激损伤与心血管疾病、炎症反应和代谢疾病联系密切，线粒体自噬是通过溶酶体选择性清除受损线粒体的质量控制机制。Atg8是自噬体形成的关键蛋白，通过与磷脂酰乙醇胺结合参与自噬体膜的形成。LC3是Atg8的同源形式之一，定位在自噬体膜上，是目前检测和研究自噬机制的标志性蛋白。LC3是参与自噬小体形成的主要蛋白，当自噬发生时，胞质型LC3（LC3Ⅰ）被APG7L/Atg7激活，转变成膜型LC3（LC3Ⅱ）并附着于自噬体膜上，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可评估自噬水平的高低。

线粒体自噬过程中，LC3接头蛋白和LC3受体发挥了关键作用，其通过泛素依赖、独立途径或与受体直接作用的方式识别受损线粒体。泛素结合蛋白p62是LC3接头蛋白之一。p62含泛素结合域（UBD）和LC3相互作用基序（LIR），在通过UBD结合耦联于线粒体蛋白K63的多聚泛素化底物时，其LIR与自噬体膜上的LC3受体直接结合，诱导自噬。以p62为代表的LC3接头蛋白是引导自噬体与泛素化分子结合的桥梁，自噬发生时，其作为泛素化底物被包裹进自噬小体降解，通常p62水平与自噬活性成反比。

本研究结果显示，与正常对照组比较，模型组大鼠胸主动脉组织自噬相关蛋白Atg8、LC3、p62表达升高，推测在高血压病理条件下，血管内皮细胞线粒体自噬过度激活，进而出现内皮功能障碍，导致高血压发生；与模型组比较，天麻芎苓止眩片组大鼠胸主动脉组织Atg8、LC3、p62表达降低，且与卡托普利组水平相当，表明天麻芎苓止眩片能改善内皮损伤，抑制线粒体过度自噬。通常情况下，p62水平与自噬程度成反比，而在本研究中，模型组p62和LC3Ⅱ表达同时升高，可能与自噬底物p62在自噬早期存在清除滞后现象，或p62与自噬体膜结合不牢固有关。天麻芎苓止眩片组和卡托普利组p62和LC3Ⅱ表达同时减少，可能是存在其他非自噬途径参与p62的合成与降解，导致p62表达的滞后性。因此，将p62作为自噬标记物可能无法真实反映自噬水平。

综上所述，天麻芎苓止眩片能有效降低自发性高血压大鼠血压，其机制可能与改善炎症稳态失衡、调节血管内皮细胞自噬、改善内皮功能有关。同时本研究发现，p62作为自噬标记物可能无法准确评价细胞自噬的真实状态。今后本课题组将继续深化自噬与高血压的关联机制、炎症与自噬相互作用及天麻芎苓止眩片的干预研究，以期为高血压的中医药防治提供参考。