基于NR3C1/p53/SLC7A11通路探讨龙牙楤木总皂苷及其成分楤木皂苷A对缺氧/复氧诱导的心肌细胞铁死亡的影响

梁芳，鲁卫星，周天琪，王胤博

1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029

心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是指缺血心肌在恢复血流供应后出现更为严重的损伤，也是血运重建术后出现致死性心律失常、梗死面积扩大甚至猝死等主要原因之一，因此减轻血管再通后MIRI成为临床亟待解决的问题。有研究显示，铁死亡参与了MIRI过程，而p53在调控细胞铁死亡方面发挥着重要作用。研究发现，在MIRI中，糖皮质激素受体NR3C1表达下调，而NR3C1的激活可抑制p53转录活性。课题组前期研究发现，龙牙楤木总皂苷（As）能减轻缺氧/复氧（H/R）诱导的心肌细胞铁死亡，但未涉及铁死亡相关机制研究。笔者通过网络药理学分析发现，NR3C1是As主要成分楤木皂苷A（As A）和MIRI的共同靶基因。基于此，本实验通过构建H/R诱导的AC16心肌细胞损伤模型，采用细胞转染技术过表达或沉默NR3C1，观察As和As A对NR3C1/p53/SLC7A11通路的影响，探讨其调控H/R诱导的心肌细胞铁死亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与药物

AC16人心肌细胞购自美国模式培养物集存库；As由吉林省中医药研究院提供，以DMSO溶解，配制成浓度为1 g/L贮备液；As A购自上海源叶生物公司，以DMSO溶解，配制成浓度为50 mg/mL贮备液。

1.2 主要试剂与仪器

胎牛血清（美国Gibco公司，批号1861242），DMEM无糖培养基（美国Gibco，货号11966025），DMEM高糖培养基（美国Hyclone公司，货号SH30022.01），DHE荧光探针（南京凯基生物公司，货号KGAF019），谷胱甘肽（GSH）ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特公司，货号E-EL-0026c），丙二醛（MDA）ELISA 试剂盒（武汉伊莱瑞特公司，货号E-EL-0060c），NR3C1抗体（英国Abcam公司，货号ab261862），p53、SLC7A11抗体（美国CST公司，货号分别为2524S、12691S），Lipofectamine 2000转染试剂（美国Invitrogen公司，货号11668019）。超净台（苏州净化设备公司，型号SW-CJ-1FD），全自动凝胶成像系统（上海天能，型号4100），RT-PCR仪（美国Bio-Rad，型号iQ5），电泳仪（上海天能公司，型号EPS300），电热恒温培养箱（上海博迅实业公司，型号BPX-82），台式高速离心机（安徽中科中佳科学仪器公司，型号HC-3618R）。

1.3 造模

AC16细胞用完全培养基（含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基），置于37 ℃、常氧培养箱中（5%CO、21%O、74%N）培养。H/R损伤模型制备时，将细胞培养液换成缺氧培养液（氮气预饱和的无血清、无糖DMEM培养基），并移至缺氧培养箱（94%N、5%CO、1%O）培养相应时间，再换成完全培养基并移至常氧培养箱培养相应时间。将细胞分别缺氧12 h/复氧12 h、缺氧24 h/复氧12 h、缺氧48 h/复氧12 h处理，同时设置对照组（缺氧0 h/复氧0 h），RT-PCR和Western blot分别检测NR3C1、p53 mRNA和蛋白表达，确定造模条件。

1.4 分组及给药

取对数生长期AC16细胞，按2×10个/孔密度接种于6孔板。将细胞分为8组。①正常组：正常培养，不做任何处理；②H/R组：按优选的造模条件造模，即缺氧24 h/复氧12 h；③As组（As＋H/R）：0.1 μg/mL As预处理6 h后进行造模处理；④As A组（As A＋H/R）：50 μg/mL As A预处理6 h后进行造模处理；⑤过表达空载体组（过表达空载体＋H/R）：转染NR3C1空载体48 h后进行造模处理；⑥NR3C1过表达组（NR3C1＋H/R）：转染NR3C1质粒48 h后进行造模处理；⑦沉默对照组（si-NC＋As＋H/R）：转染si-NC质粒48 h后0.1 μg/mL As预处理6 h，进行造模处理；⑧NR3C1沉默组（si-NR3C1＋As＋H/R）：转染si-NR3C1质粒48 h后0.1 μg/mL As预处理6 h，进行造模处理。

1.5 细胞转染

AC16细胞以2×10个/孔密度接种于6孔板，待细胞生长融合至70%～80%时进行转染。将转染试剂Lipofectamine 2000和质粒恢复至室温，取5 μL Lipofectamine 2000用250 μL DMEM高糖培养基稀释，室温静置5 min；另取250 μL DMEM高糖培养基，加入2.5 μg质粒（NR3C1质粒、NR3C1空载体、si-NR3C1质粒或si-NC质粒），轻轻吹打均匀，将Lipofectamine 2000稀释液加入质粒溶液中混匀，室温静置20 min；提前5 min从培养箱中取出细胞，DMEM高糖培养基清洗细胞1次，每孔加入1.5 mL DMEM高糖培养基，将质粒-转染试剂混合液逐滴加入各孔中，每孔0.5 mL，轻轻晃动混匀，继续放入37 ℃、5%CO培养箱中培养5 h，弃去培养液，加入完全培养基继续培养48 h后进行后续处理。

1.6 RT-PCR检测

收集各组细胞，Trizol法提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度，将RNA反转录为cDNA，根据说明书配制反应体系，进行RT-PCR，采用2法计算NR3C1和p53 mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.7 活性氧水平检测

以DMSO溶解DHE，制成5 mmol/L贮备液，用DMEM高糖培养基将贮备液稀释成终浓度为5 μmol/L的工作液。弃去细胞培养液，每孔加入1 mL工作液，37 ℃避光孵育20～30 min，DMEM高糖培养基清洗细胞，流式细胞仪观察，计算ROS含量。

1.8 丙二醛和谷胱甘肽含量检测

细胞经分组处理后，弃去培养基，预冷PBS洗涤细胞1次，收集细胞，1 000×离心5 min，弃去上清液，沉淀加入200 μL PBS重悬，反复冻融破碎细胞，4 ℃、1 500×离心10 min，取上清液，按ELISA试剂盒说明书操作，酶标仪波长450 nm处检测各孔吸光度，计算MDA和GSH含量。

1.9 Western blot检测

收集各组细胞，加入适量裂解液冰上裂解45 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，BCA法测定蛋白浓度。将蛋白样品与5×上样缓冲液混合，100 ℃处理5 min。电泳后转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入NR3C1、p53、SLC7A11一抗（均按1∶500稀释），4 ℃孵育过夜，TBST洗涤4次，加入相应二抗（1∶1 000），37 ℃孵育2 h，TBST洗涤4次，滴加ECL化学发光液显影，凝胶成像系统进行分析，计算目的蛋白相对表达量。

1.10 免疫荧光检测

细胞经分组处理后，弃去培养基，4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS洗5 min×3次，0.3%Triton X-100破膜5 min，10%羊血清室温封闭1 h，加入NR3C1、p53一抗（1∶200），4 ℃孵育过夜，PBS洗5 min×3次，加入荧光二抗（1∶300）避光孵育2 h，PBS洗5 min×2次，加入DAPI（1∶1 000）室温避光孵育7～10 min，PBS洗5 min×3次，荧光显微镜下观察并拍照，计算NR3C1和p53荧光强度。

1.11 统计学方法

采用SPSS24.0统计软件进行分析。计量资料以±表示，数据经正态性检验，服从正态分布，组间比较用方差分析。＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同缺氧/复氧时间对AC16细胞NR3C1和p53 mRNA及蛋白表达的影响

与缺氧0 h/复氧0 h比较，缺氧12 h/复氧12 h、缺氧24 h/复氧12 h、缺氧48 h/复氧12 h处理后，AC16细胞NR3C1 mRNA和蛋白表达明显降低，p53 mRNA和蛋白表达明显升高，且呈时间依赖性（＜0.05）。当缺氧24 h/复氧12 h时，p53 mRNA表达明显上调、NR3C1 mRNA表达明显下调，因此选择缺氧24 h/复氧12 h进行后续实验。见表2、图1。

表2 不同H/R造模条件对AC16细胞NR3C1和p53 mRNA及蛋白表达的影响（±s）

图1 不同H/R造模条件下AC16细胞NR3C1、p53蛋白免疫印迹

2.2 龙牙楤木总皂苷及楤木皂苷A对AC16细胞活性氧水平的影响

与正常组比较，H/R组AC16细胞ROS水平明显升高（＜0.05）；与H/R组比较，As组、As A组和NR3C1过表达组AC16细胞ROS水平明显降低（＜0.05）；与过表达空载体组比较，As组和NR3C1过表达组AC16细胞ROS水平明显降低（＜0.05）；与AS组及沉默对照组比较，NR3C1沉默组AC16细胞ROS水平明显升高（＜0.05）。见表3。

表3 各组AC16细胞ROS水平比较（±s，%）

2.3 龙牙楤木总皂苷及楤木皂苷A对AC16细胞丙二醛、谷胱甘肽含量的影响

与正常组比较，H/R组AC16细胞MDA含量明显升高，GSH含量明显降低（＜0.05）；与H/R组比较，As组、As A组和NR3C1过表达组AC16细胞MDA含量明显降低，GSH含量明显升高（＜0.05）；与过表达空载体组比较，As组和NR3C1过表达组AC16细胞MDA含量明显降低，GSH含量明显升高（＜0.05）；与AS组及沉默对照组比较，NR3C1沉默组AC16细胞MDA含量明显升高，GSH含量明显降低（＜0.05）。见表4。

表4 各组AC16细胞MDA、GSH含量比较（±s）

2.4 龙牙楤木总皂苷及楤木皂苷A对AC16细胞NR3C1、p53和SLC7A11蛋白表达的影响

Western blot结果显示，与正常组比较，H/R组AC16细胞NR3C1和SLC7A11蛋白表达明显降低，p53蛋白表达明显升高（＜0.05）；与H/R组比较，As组、As A组和NR3C1过表达组AC16细胞NR3C1和SLC7A11蛋白表达明显升高，p53蛋白表达明显降低（＜0.05）；与过表达空载体组比较，As组和NR3C1过表达组AC16细胞NR3C1、SLC7A11蛋白表达明显升高，p53蛋白表达明显降低（＜0.05）；与As组及沉默对照组比较，NR3C1沉默组AC16细胞NR3C1、SLC7A11蛋白表达明显降低，p53蛋白表达明显升高（＜0.05）。见图2、表5。

表5 各组AC16细胞NR3C1、p53和SLC7A11蛋白表达比较（±s）

图2 各组AC16细胞NR3C1、p53和SLC7A11蛋白免疫印迹

免疫荧光结果显示，与正常组比较，H/R组AC16细胞NR3C1荧光强度降低，p53荧光强度升高，差异有统计学意义（＜0.05）；与H/R组比较，As组、As A组及NR3C1过表达组AC16细胞NR3C1荧光强度升高，p53荧光强度降低，差异有统计学意义（＜0.05）；与过表达空载体组比较，As组和NR3C1过表达组AC16细胞NR3C1荧光强度升高，p53荧光强度降低，差异有统计学意义（＜0.05）；与As组及沉默对照组比较，NR3C1沉默组AC16细胞NR3C1荧光强度降低，p53荧光强度升高，差异有统计学意义（＜0.05）。见图3、表6。

图3 各组AC16细胞NR3C1和p53阳性表达（免疫荧光染色，×200）

表6 各组AC16细胞NR3C1和p53荧光强度比较（±s）

3 讨论

根据临床表现，MIRI属中医学“胸痹”“真心痛”范畴。病机多为本虚标实，以气虚血瘀为多见，其所致瘀血、痰浊等病理产物阻滞心脉，故治以益气活血、化痰通络为主。龙牙楤木为五加科楤木属植物，主产于我国黑龙江、吉林、辽宁等地，其味辛、微苦、甘，性平，具有益气活血、安神、止痛、利水、祛风湿等功效，龙牙楤木总皂苷是其主要活性成分。本课题组前期研究发现，龙牙楤木总皂苷可通过减轻氧化应激、降低炎症反应、减少钙超载、调节线粒体ATP敏感性钾通道等途径发挥对MIRI大鼠心脏的保护作用。

铁死亡是一种新的细胞死亡方式，其主要特征是Fe水平升高、ROS堆积、GSH合成下降、脂质过氧化产物如MDA等含量增加，导致细胞膜破损甚至细胞死亡。SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸反向转运体的组成部分，参与GSH合成，抑制SLC7A11表达可降低GSH活性。有研究显示，p53可通过抑制SLC7A11表达促进铁死亡。NR3C1可影响生长、代谢、炎症与应激反应等过程，以及心血管系统中的其他生物学过程，并参与调节p53活性。

本研究发现，在不同H/R时间造模条件下，AC16细胞NR3C1 mRNA和蛋白表达降低，p53 mRNA和蛋白表达升高，且呈时间依赖性。经As、As A处理后，NR3C1蛋白表达及GSH水平明显升高，p53蛋白表达及ROS、MDA水平明显降低。NR3C1过表达组AC16细胞p53蛋白表达及ROS、MDA水平较H/R组和过表达空载体组明显降低，SLC7A11蛋白表达和GSH水平明显升高，提示NR3C1可能通过p53/SLC7A11途径抑制H/R诱导的心肌细胞铁死亡，降低氧化应激水平。同时，NR3C1沉默组AC16细胞p53蛋白表及ROS、MDA水平达较As组及沉默对照组明显升高，SLC7A11蛋白表达和GSH水平明显降低，进一步说明As通过NR3C1/p53/SLC7A11通路抑制心肌细胞铁死亡。

综上所述，As及As A可抑制H/R诱导的AC16心肌细胞铁死亡，保护心肌细胞，其机制可能与上调NR3C1和SLC7A11蛋白表达、下调p53蛋白表达有关。