益肾养髓方对脊髓型颈椎病大鼠受损脊髓微血管再生的影响

唐彬，朱立国，陈忻，杨博文，秦晓宽，金哲峰，魏戌，刘志伟，孙凯，银河

1.中国中医科学院望京医院，北京 100102；

2.北京中医药大学，北京 100029

脊髓型颈椎病（cervical spondylotic myelopathy，CSM）是由于椎间盘及颈椎小关节退变、椎体边缘骨赘形成，对椎管形成占位并压迫脊髓或支配脊髓的血管，造成脊髓受压和/或缺血而引起的脊髓传导功能障碍性疾病。CSM可导致患者明显的肢体感觉或运动功能障碍。益肾养髓方针对该病本虚标实病机，以益肾活血类中药为主，用于治疗CSM早、中期病情平稳、手术指征不明显患者获得比较满意的疗效。本研究针对CSM受压后局部出现微循环障碍的病理特点，采用脊髓慢性压迫法建立CSM大鼠模型，观察益肾养髓方对模型大鼠神经功能评分、受损脊髓组织形态及微血管形态的影响，初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雌性SD大鼠30只，体质量240～280 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2017-0033。饲养于室温、通风良好、自然光照环境，自由摄食饮水。喂食大鼠繁殖颗粒饲料，适应性喂养1周。

1.2 药物及制备

益肾养髓方（巴戟天9 g，熟地黄12 g，鹿角霜12 g，白芍12 g，黄芪15 g，桂枝6 g，丹参9 g，鬼箭羽12 g，羌活6 g），饮片购于中国中医科学院望京医院药剂科，煎煮后水浴浓缩，用纯净水对浓缩后的药液进行等比稀释，配制成浓度分别为0.419、0.837、1.674 g/mL的低、中、高浓度药液，置于4 ℃冰箱冷藏备用。

1.3 主要试剂与仪器

HE染色试剂盒（货号G1120）、CD34多克隆抗体（货号K009406P）、中性树胶（货号G8590）、柠檬酸钠抗原修复液（货号C1031）、苏木素染色液（货号G1080），北京索莱宝科技有限公司。刀柄、眼科剪、线剪、有齿镊、无齿镊、持针器、弯钳、直钳、单关节骨剪，上海医疗器械（集团）有限公司；电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司，型号KH-5000E），电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，型号AE160），组织脱水机（德国徕卡公司，型号ASP200S），组织包埋机（德国徕卡公司，型号EG1150C），石蜡切片机（德国徕卡公司，型号RM2245）。

1.4 造模、分组及给药

将大鼠分为假手术组（6只）和造模组（24只），采用吸水膨胀材料聚乙烯醇聚丙烯酰胺互穿网络水凝胶（北京师范大学化学学院提供）压迫脊髓法制备CSM大鼠模型。2%戊巴比妥钠腹腔注射（40 mg/kg）麻醉大鼠，剃除颈背部毛发，常规碘伏消毒，颈椎后正中切口3～4 cm，切开皮肤，暴露颈肩部肌肉群，找到最高突起处及C棘突，自下向上正中切开肌肉群并向两侧牵拉，用刀片剥离棘突两侧附着的肌肉，暴露颈椎椎板，剔除椎板间黄韧带，从C～T间隙将吸水膨胀材料（1.5 mm×0.7 mm×0.3 mm）向上植入C～C椎板，植入后逐层缝合肌肉、皮肤。假手术组采用同样方法暴露椎板，剔除椎板间黄韧带，将同体积吸水膨胀材料植入C～C椎板后随即取出，不造成持续脊髓压迫。术后连续3 d肌肉注射青霉素（8万U/d）预防感染，常规条件饲养，每日早晚人工挤压膀胱协助排尿，至形成反射性排尿为止。为使大鼠脊髓急性压迫转为慢性压迫，术后适应性观察2周后开始灌胃给药。根据Basso Beattie Bresnahan（BBB）评分将造模大鼠随机分为模型组及益肾养髓方低、中、高剂量组，每组6只。给药剂量以70 kg成人与200 g大鼠的体表面积进行换算，分别灌胃4.19、8.37、16.74 g/kg（相当于临床成人用量的0.5、1、2倍）益肾养髓方药液，模型组和假手术组灌胃等量0.9%氯化钠注射液，体积均为1 mL/100 g，每日1次，连续4周。

1.5 行为学评分

BBB评分用于评估大鼠后肢运动功能的恢复情况。将大鼠置于平台上，观察记录其后肢的行走及肢

体活动，正常大鼠满分21分。分别于灌胃前和灌胃第2、4周对大鼠进行BBB评分。

1.6 取材

戊巴比妥钠腹腔注射（40 mg/kg）麻醉大鼠，手术剪打开大鼠胸腔，暴露心脏，将灌流针针头从左心室靠近心尖搏动处插入，用0.9%氯化钠溶液250 mL冲洗，待肝脏和肺脏颜色转白且右心房流出液体澄清，再用4%多聚甲醛溶液进行灌流，当大鼠出现四肢抽搐、四肢及尾巴僵硬、全身强直时停止灌流。取C～C节段脊髓，置于4%多聚甲醛中固定，用于HE、免疫组化染色。

1.7 HE染色

将脊髓组织置于4%多聚甲醛中固定过夜，石蜡包埋，切片（厚度约5 μm），二甲苯脱蜡，梯度乙醇（100%、90%、80%、75%）浸泡脱水，每个梯度10 min，苏木素染色，蒸馏水冲洗，伊红染色，蒸馏水冲洗，梯度乙醇（75%、80%、90%、100%）脱水，二甲苯透明，自然晾干，中性树胶封片，显微镜下观察脊髓组织病理变化。

1.8 免疫组化染色

石蜡切片按“1.7”项下步骤脱蜡后，3%HO浸泡10 min，自来水冲洗，柠檬酸缓冲液煮3 min×2次，进行热抗原修复，PBS冲洗2次，加6%山羊血清于37 ℃温箱孵育30 min，滴加CD34一抗（1∶100），4 ℃孵育过夜，PBS洗3次，滴加二抗（1∶100），37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，DAB染色，苏木素复染，自来水冲洗，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

参照Weidner方法进行微血管计数。先在40倍光镜下观察整张切片，寻找微血管密度较高区域，即“密集区”。随后在400倍光镜下计数被染成棕色的血管内皮细胞簇，与邻近微血管分开且有微血管腔者计为1个微血管。每只大鼠微血管数以5个400倍视野下微血管数目平均值计算。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 益肾养髓方对模型大鼠行为学评分的影响

与同一时点假手术组比较，模型组大鼠BBB评分明显降低（＜0.05）；与模型组比较，益肾养髓方高剂量组大鼠灌胃第2周BBB评分明显升高（＜0.05），益肾养髓方高、中剂量组大鼠灌胃第4周BBB评分明显升高（＜0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠不同时点BBB评分比较（±s，分）

2.2 益肾养髓方对模型大鼠脊髓组织病理形态的影响

假手术组大鼠脊髓组织神经细胞形态完好，细胞核完整，脊髓组织结构正常，无空泡样改变；模型组大鼠脊髓组织可见大量神经细胞核固缩，细胞肿胀、坏死，有大量纤维瘢痕组织及大空泡样改变；益肾养髓方低剂量组大鼠脊髓组织可见大量小空泡样改变及固缩的神经细胞核呈游离状态分布，存在形态正常的神经细胞；益肾养髓方中剂量组大鼠脊髓组织空洞较小，有少量纤维瘢痕组织及固缩的神经细胞核，神经细胞形态趋于正常；益肾养髓方高剂量组大鼠脊髓组织可见少量空洞及纤维瘢痕组织，空洞周围存在大量神经细胞，有少量神经细胞核固缩，细胞核分布逐渐集中。见图1。

图1 各组大鼠脊髓组织形态（HE染色，×400）

2.3 益肾养髓方对模型大鼠脊髓组织微血管数目的影响

免疫组化染色可见微血管内皮细胞胞浆被染成棕黄色，微血管呈梭形或分支状分布。假手术组大鼠脊髓前动、静脉及微循环血管管腔清晰，形态正常；模型组大鼠脊髓慢性压迫处脊髓前动、静脉受压变扁，微血管稀疏、管壁变薄，边界不清，白质受压严重处微血管数目减少，灰质仅见少量微血管分布；益肾养髓方低剂量组大鼠脊髓前动、静脉受压变形，受压处白质、灰质微血管数目减少，但优于模型组；益肾养髓方中、高剂量组大鼠脊髓前动、静脉受压变形，受压处白质、灰质有微血管分布，且微血管数目较益肾养髓方低量组有所增加。

与假手术组比较，模型组大鼠脊髓组织微血管数目明显减少，差异有统计学意义（＜0.05）；与模型组比较，益肾养髓方中、高剂量组大鼠脊髓组织微血管数目明显增加，差异有统计学意义（＜0.05）。见图2、表2。

表2 各组大鼠脊髓组织微血管数目比较（±s，个）

图2 各组大鼠脊髓组织CD34阳性表达（免疫组化染色，×400）

3 讨论

根据临床症状，CSM属中医学“痉证”“痿证”范畴，其病位在脊髓，病机主要为气滞血瘀，阻滞经络而出现机体失用。与现代医学认为脊髓受压、脊髓血供减少、脊髓神经功能障碍观点相符。脊髓微循环功能正常是维持脊髓神经功能的基础，脊髓血供的60%～70%由脊髓前正中纵行的脊髓前动脉及相应的沟动脉提供。脊髓前动脉最易受到椎体骨突、椎间盘的压迫，机械压迫导致脊髓血管内皮细胞破裂，基底膜外露，血小板黏附，甚至形成微栓子，造成髓内小动脉与小静脉阻塞。压迫脊髓造成的脊髓微循环障碍不仅与应激性激活凝血系统使血液处于高凝状态有关，也与血管内皮损伤有关，还与自由基引起微血管闭塞或痉挛，从而导致延迟性缺血等有关。缺血缺氧也可导致细胞营养供应不足，进而诱导或加重神经细胞自噬。脊髓受压除直接损伤血管外，也可能使脊髓后横径增大，横向走行的血管被拉长，血管口径变小，脊髓微血管循环改变、脊髓血供减少而影响脊髓功能，出现神经症状。可见，脊髓血供与脊髓微血管形态、面积是否正常相关，脊髓微循环功能又取决于神经元的数量和功能。

CD34分子是一种高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，选择性地表达于血管内皮细胞表面，是血管内皮细胞中较敏感的分子标记物。CD34可激活血管内皮细胞，使其在黏附分子和趋化因子的共同作用下发生迁移，有利于内皮修复和血管重建。故CD34分子能较好地反映大鼠脊髓组织微循环的改善情况。

针对CSM气滞血瘀致肝肾亏虚的病机特点，采用补益肝肾、活血通督为主要治法。益肾养髓方是课题组在经典名方地黄饮子基础上结合大量临床经验总结提炼而成，方中巴戟天补肾温阳、强筋壮骨，熟地黄补血滋阴、益精填髓，二药合而为君；臣药鹿角霜温肾助阳，白芍养阴柔肝；佐使药黄芪、桂枝益气升阳、温经通脉，鬼箭羽、丹参活血通经、通络止痛，羌活祛风湿、利关节，助太阳气化，畅督脉经气，使药力达于颈部。针对CSM“本虚标痹”的病机，共奏补肝益肾、活血通经之效。益肾养髓方灌胃干预可显著促进大鼠脊髓压迫后神经功能的恢复。通过不同灌胃剂量比较发现，益肾养髓方高、中剂量效果较好。有研究显示，温阳通督类中药可显著降低家兔血液黏稠度，减少红细胞压积及降低红细胞聚集指数，促进神经修复，与本研究结果一致。益肾养髓方中丹参主要成分丹参酮ⅡA磺酸钠可改善脊髓缺血再灌注损伤。黄芪能降低脊髓缺血损伤大鼠血清神经元特异性烯醇化酶浓度，降低水通道蛋白4表达，减轻脊髓水肿；还能缓解受压后脊髓的脂质过氧化反应，改善微循环，从而起到保护脊髓的作用。以上研究为益肾养髓方的疗效提供了相关药理学证据。

综上，益肾养髓方可提高CSM模型大鼠行为学评分，改善受损脊髓组织形态，减少纤维瘢痕组织产生，促进脊髓慢性压迫后神经细胞的修复，同时增加脊髓微血管数目，具有改善脊髓血液循环、恢复血液供应及脊髓功能的作用。